загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Рибонуклеїнові кислоти вірусів грипу

М. В. Лонсі (М. W. PONS)

I. ВСТУП

Вірус грипу має унікальний в порівнянні з іншими вірусами тварин спектр біологічних властивостей. Він має здатність. До множинної реактивації (Hoyle, Liu, 1951), утворення неповних вірусних частинок (von Magnus, 1954), чутливий до антіноміціну D (Barry et al., 1962), його нуклеїнова кислота неінфекційні-і він має здатність до генетичної рекомбінації (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Це остання властивість. Дозволило висловити припущення, що геном вірусу грипу складається з двох або більшої кількості фрагментів однонитчатим рибонуклеїнової кислоти (РНК), а не з одного ланцюжка ковалентно пов'язаних нуклеотидів (Burnet, 1956; Hirst, 1962). Згодом ця біологічна гіпотеза була підтверджена біохімічним аналізом РНК, ізольованої з внр'іонов (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1968а), л тим фактом, що внутрішньоклітинна репликативная форма вирионной РНК також існує у вигляді окремих фрагментів (Pons. Hirst, 1968) .

Рибонуклеїнова кислота вірусу грипу становить 0,8 - 1,1% сухої маси вірусної частки (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956; Frommhagen et al., 1959). Хімічний аналіз РНК, ізольованої з очищених ві-Ріоні, дозволив оцінити масу РНК 2-Ю6-3-Ю6, що міститься в одній вірусної частці (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956). Отримана величина, однак, є 'без сумніву занадто малою. Хоча вона і досить близька до загальноприйнятої величиною 4,5 - 10s-5-Ю6 РНК «а один вирион, занадто мале процентний вміст РНК в вирионе грипу,. А також (або) присутність в вірусної популяції неповних вірусів можуть з'явитися причиною заниженої оцінки кількості РНК, що входить до складу однієї вірусної частки (див. розділ ШВ).

II. МЕТОДИ

А. КУЛЬТИВУВАННЯ І ОЧИЩЕННЯ ВІРУСІВ ГРИПУ

Існує кілька різних методів очищення вірусів грипу. Описаний тут метод постійно використовується в нашій лабораторії, а також, з невеликими модифікаціями, в деяких інших наукових групах. Метод однаково придатний для очістш вірусу, культивованих як на курячих ембріонах, так, і на монослойной культурі фібро-бластів курячого ембріона (CEF). Крім того, за допомогою цього методу отримують препарати вірусу високого ступеня чистоти з 40% виходом щодо вихідного кількості віріонів при дуже невеликий. Втраті інфекційне ™ і ге-магглютінірующей активності. У. Даний час описані і інші методи очищення (в 'зокрема, з використанням для осадження сульфату амонію), за допомогою яких також отримують вірусні препарати високої чистоти, однак висока' концентрація солі, використовувана в цих методах, надає небажана дія на інфекційність віріонів. Необхідно відзначити, що основна вимога, що пред'являється до описаних тут-методикам, полягало в мінімальному впливі на інфекційність вірусу.

У більшості біохімічних робіт, виконаних на вірусах грипу США, в якості об'єкта дослідження використовували штам WSN. У Європі ж увага зосередилася на вивченні FPV, іншого штаму вірусу грипу А. Відмінності між цими двома штамами (зокрема, в нуклеїнових кислотах і їх реплікації), ймовірно, не особливо великі.

Штам WSN зазвичай культивується на первинній культурі фнбробластов курячих ембріонів (CEF). Для отримання великих кількостей вірусу [порядка 5-Ю10-10-Ю10 бляшкообразующіх одиниць (БОЮ)] 40-60 суцільних монослоев інокуліруютея з вірусом з множинністю зараження приблизно 5-Ю "" 5 БОЮ на клітину. Монослои інкубують при 37 ° С протягом 40 год в атмосфері 5% СО2 (Simpson, Hirst, 1961), і вірус виділяють з сулернатанта за методикою, описаної далі. Для отримання радіоактивно міченого вірусу в систему безпосередньо перед інкубацією при 37 ° С додають потрібні ізотопи, зазвичай [3Н]-5-уридин (2 - 5 М'кК! Та / мл) або [3Н]-або, [14С]-амінокислоти (2-4мкКі/мл).

Після обробки РНК-азой вірус нашаровують поверх 4 мл 30% сахарози в буфері STE і центрифугують протягом 1 год при 145 000 g. До осаду додають буфер STE, суміш гомогенізують для того, щоб повністю ресуслендіровать вірус, і центрифугують для видалення дебриса на малій швидкості. Сулернатант нашаровують на лінійний градієнт сахарози (по 10 мл 30-60% сахарози в буфері STE), покритий шаром мінерального масла (10 мл) і центрифугують до рівноваги протягом 17 год при 96 000 g. Відомий візуально шар вірусу виявляють в області густин 1,18-1,19 г/см3 і відбирають по фракціях (1 мл), починаючи з дна пробірки. Сахарозу видаляють з вірусної суспензії або хроматографією через сефадексе Г-50, або за допомогою осадження вірусу центрифугированием протягом 60 хв при 145 000 g і ресуспендування осаду в буфері STE.

Б. ЕКСТРАКЦІЯ віріони РНК

1. Екстракція РНК з віріонів

Вірус, очищений за описаною методикою і обкладена для видалення сахарози, переводять в малий обсяг буфера STE (зазвичай 0,2-0,4 мл). Після повного ресуспендування осаду додають 1-2 мл буфера SLA (0,5% SDS, 0,14 М LiCl в 0,01 М ацетатного буфера, рН 4,9) і рівний об'єм суміші свежеперегнанного водонасиченого фенолу з хлороформом (1: 1) . Суміш збовтують 'вручну протягом 4 хв, фази розділяють центрифугированием на низькій швидкості і верхній водний шар обережно відсмоктують без порушення цілісності інтерфази. Після додавання подвійного об'єму 95% етанолу РНК випадає в осад протягом ночі яри температурі -20 ° С, осад відокремлюють центрифугуванням, розчиняють у відповідному буфері і вдруге осаджують спиртом. Якщо передбачається проводити аналіз РНК за допомогою

ПААГЕ, вкрай важливо, щоб РНК після першого осадження спиртом розчинялася в електрофорез-ном буфері (5 мМ ЕДТА, 10 мМ NaCl, 0,05% SDS, 5 мМ трис-HCl, рН 7,4). Якщо концентрація NaCl хоча б трохи перевищить величину 10 мМ, це призведе до того, що велика кількість РНК залишиться у верхній частині гелю, а Електрофореграма 'буде низької якості.

З клітки можуть. Бути екстрагованих три типи вірусспе-ціфічеокіх РНК: 1) вірлонная РНК (вРНК), 2) РНК, комплементарна до вирионной (вкРНК), 3) двунитчатая РНК (днРНК). Щодо чисту вРНК вдається ізолювати з нукленново-білкового комплексу - рибонуклеопротеидов (РНП). Метод виділення буде описаний в розділі VA, 1 цієї глави). Виділення вкРНК зазвичай відбувається при виділенні РНК з препарату полісом, оскільки основна частина, якщо

не вся вірусна інформація (Мессенжер) РНК (мРНК), являє собою вкРНК (розділ VB, 1).

У декількох роботах 'була описана ізоляція з інфікованих клітин вірусопеціфіческой днРНК (Pons, 1976b;. Pons, Hirst, 1968b). Метод ізоляції включає обробку інфікованих клітин сумішшю фенолу з SDS з наступною хроматографією ізольованою РНК на колонках з целюлозою CFll (Franklin, 1966) і виділенням продукту, на 90% складається з молекул, стійких, до обробки РНК-азой. РНК, ізольовані цими-методами, при вивченні їх за допомогою ПААГЕ, давали шість добре дозволених фрагментів вірусспеціфічехжой РНК (26). Денатурація днРНК за допомогою диметилсульфоксиду приводила «до виникнення однонитчатим РНК (онРНК) з електрофоретичної рухливістю, еквівалентної такої фрагментів вРНК (Pons, Horst, 1968b).

В. АНАЛІЗ екстрагувати РНК

В даний час є багато методів ізоляції вірусної РНК з інфікованих клітин і віріонів. Вибір того чи іншого методу диктується у великій мірі методикою аналізу продукту і тим, жак цей продукт буде використовуватися. Це означає, що якщо необхідно вивчити 'біологічну активність екстрагованої РНК, то в процесі виділення бажано присутність малих кількостей Mg2 +. Однак наявність в системі Mg2 + призводить до агрегації РНК вірусу грипу і, якщо агрегати не видалити (наприклад, за допомогою додавання ЕДТА) до аналізу, можна отримати помилкові дані при дослідженні зразків РНК за допомогою методу швидкісний седиментації. У більшості випадків вірус-специфічні РНК екстрагують за допомогою суміші фенол-хлороформ (1:1) у присутності SDS (Penman, 1969) в буфері SLA.

1. Аналіз екстрагованої РНК за допомогою градієнтного центрифугування

Швидкісне градієнтне центрифугування є найпростішим методом визначення седиментаційних параметрів і одержання основної інформації про віріони і вирусспецифических РНК-рибонуклеїнової кислоти, отриману з віріонів, оброблених сумішшю фенол-хлороформ SDS, ресуспендіруют після осадження спиртом в буфері STE. РНК нашаровують на лінійний (10-35%) гліцериновий градієнт (обсяг одиничного градієнта 17 мл) в 'буфері STE, що містить 1 М сечовину (STEU-буфер). Нами було виявлено, що, якщо покрити центрифугальні пробірками-

ки тонким шаром силіконової змазки, це покращує дозвіл і зменшує вплив стінок під час центрифугування. Гліцерин використовують при проведенні 'більшості дослідів (виключаючи досліди з вивчення полісом), оскільки він має більш низьку щільність, ніж сахароза; на відміну від сахарози може бути підданий автоклавнрованію для стерилізації та руйнування домішкових РНК-аз; не замерзає при температурі -20 "З , а це вирішує ряд проблем, що виникають при заморожуванні біологічного матеріалу, і, нарешті, гліцерин є більш слабким, ніж сахароза, гасителем в більшості сцинтиляційних рідин.

Після проходження вірусної РНК через гліцериновий градієнт при центрифугировании при 120000 g протягом 17 год фракції (по 1 мл) збирають, починаючи від дна центрифужной пробірки, і визначають радіоактивність кожної фракції. Як видно з 27, за допомогою цієї методики РНК можна розділити на три класи з седиментаційним коефіцієнтами приблизно 18S, 14S і 11S. Якщо препа-

рат вірусу не обробити під час очищення РНК-азой, зазвичай додатково спостерігаються чотири класи з коефіцієнтами седиментації в межах 4-7S. Ймовірно, матеріал з коефіцієнтом седиментації 7S являє собою хазяйські і вільні віріони РНК, адсорбовані на поверхні віріона.

2. Аналіз екстрагованої РНК за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГЕ)

Хоча аналіз вірусної РНК за допомогою ПААГЕ і є більш складним, ніж її дослідження за допомогою седиментації, він є більш інформативним методом. В основному до теперішнього часу користувалися двома системами гелів: агарозу-акріламідним з використанням як сополімерізатора бісакріламіда (Pons, Hirst, 1968a) і ак-ріламідним гелем без агарози з використанням як 'речовини, що утворює поперечні молекулярні зшивання, етілелдіакрілата (Duesberg, 1968). Обидві системи мають свої переваги і недоліки, проте детально ми опишемо тільки першу систему. Наш досвід використання системи агароза - акриламід - бісакріламід дозволяє стверджувати, що для отримання задовільних результатів необхідно виключити кілька джерел регулярних помилок. Детальний опис самого методу наведено в роботах Pons і Hirst (1968a), а також Pons (1972). До важливих деталей експерименту, про які згадувалося раніше і які були опущені в наведених роботах, відносяться: необхідність одержання гелів і проведення електрофорезу в скляних трубках, покритих силіконовим речовиною, таким, як ді-метілдіхлорсілан; необхідність покривати гель шаром води відразу ж після змішування компонентів гелю до виникнення полімеризації і, нарешті, небажаність введення | в розчин аналізованої РНК стартового барвника. Стартовий барвник повинен поміщатися в окремий гель, приготований аналогічно гелю з аналізованої РНК.

На 28 представлена ??типова Електрофореграма РН1-уридин-міченої вРНК, ізольований з в'іріонов .. гельелектрофореза днРНК, отриманих з інфікованих клітин, показав присутність шести різних по довжині мо-текул РНК (див. 26) (Pons, Hirst, 1968). За даними Skehel (1971), за допомогою ПААГЕ можна отримати шість різних молекул онРНК, якщо руйнувати вірус за допомогою 'додецилсульфата літію. З іншого боку , Lewandowski і співавт. (1971), використовуючи інший метод, заснований на визначенні числа З'-решт, оцінили мінімальне число фрагментів РНК в одному вяріоне і отримали число 7. Таким оо-разом, в даний час, імовірно, можна стверджувати, що

геном вірусу грипу складається з 6-7 індивідуальних молекул РНК1. Невизначеність у знанні точного числа фрагментів, що містяться в одній вірусної частці робить 'неможливим точне визначення відносної молекулярної маси вірусного генома. Однак оцінка, заснована на необхідному для синтезу вирусспецифических поліпептидів кількості інформації, дозволяє стверджувати, що вірусний

геном повинен мати молекулярну масу не нижче 3,5-106-4 - 10е. Lewandowski і співавт. (1971) визначили, що сумарна молекулярна маса описаних ним семи фрагментів РНК повинна-бути не нижче 4,7-107.

Нещодавно ми застосували нову систему для електрофорезу з використанням замість циліндричних гелів плоских («слабий-гелі»). Цей метод дозволив показати, що геном вірусу грипу складається з 8 окремих шматків онРНК. При ізоляції днРНК з інфікованих «слеток також спостерігалося 8 фрагментів днРНК. В обох випадках фрагменти РНК групувалися наступним чином: 3 великих фрагмента з-близькою молекулярною масою, 3 фрагмента з проміжними розмірами і з різко различающейся молекулярною масою і 2 малих за розмірами фрагмента. Palese, використовуючи аналогічний метод аналізу онРНК, отримав 9 фрагментів РНК (Palese, персональне повідомлення). Присутність 9-то і наступних за номером фрагментів РНК (що мають більш низьку в порівнянні з іншими фрагментами . молекулярну масу), ймовірно, має відношення до множинності зараження.

  Рибонуклеїнова кислота вірусу грипу може бути проаналізована за допомогою МАК-1К0ЛОНОК за методом, описаним Mendall і Hershey (1960). У режимі градиентной еля-ції вРНК елюіруются з таких колонок при 1 М NaCl (Pons, 1967а) у вигляді окремого піку. Подальший аналіз цієї РНК при поділі за допомогою швидкісної седиментації показав, що РНК седіментірует в широкій області з середнім коефіцієнтом седиментації 18S. Таким чином, використання МАК-колонок для дослідження ізольованою вРНК має обмежені переваги перед іншими методами, проте ця методика вкрай зручна при аналізі РНК, виділеної з інфікованих. Клітин. При хроматографії на МАК-колонці такий РНК, ізольованою за допомогою суміші фенол-SDS, відбувається поділ вірусних онРНК і днРНК. Однонитчатим РНК елюіруются разом з 285-рибосомальної РНК клітини-хазяїна. Якщо таку суміш РНК клітини-господаря і вірусу спробувати розділити за допомогою швидкісної седиментації, РНК (що має середню константу седиментації 18S) і 28S-PHK клітини-хазяїна вийдуть в різних фракціях. Цим методом можна отримати відносно чисту врік, ізольовану з. Клітини.

  Ш. ФІЗИЧНІ ТА ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ РНК ВІРУСУ ГРИПУ

  А. РНК ІНФЕКЦІЙНОГО ВІРУСУ

  У попередніх розділах ми описали різні методи, які були використані для виділення та аналізу Вірі-ційної РНК. За винятком однієї роботи Li і Seto (1970), які стверджували, що 'РНК, ізольована з вірусних частинок, може бути отримана у вигляді окремої полімерної молекули, видною в електронному мікроскопі, всі дані, описані численними авторами, вказують на те, що вірусна РНК фрагментована. Як 'було зазначено вище, існує декілька думок про точне число фрагментів РНК, що входять до складу однієї вірусної частинки. Ця обставина не дозволяє визначити відносну молекулярну масу вірусного генома з якої ступенем визначеності.

  Duesberg і Robinson (1967) визначили ну-клеотідний складу вРНК, ізольованої з штаму PR8: урацила 33%, цитозину 24%, аденіну 23% і гуаніну 19,5%. "Раніше Ada і Perry (1956) виявили, що нуклеотидний склад вРНК , хоча і слабо, але безумовно варіює від штаму до штаму. Нуклеотидний складу вРНК, а також її чутливість до РНК-азе вказують на те, що вона однонитчатим. Оскільки не спостерігається еамогабрідізаціі між молекулами РНК, ізольованими з вірпонов, онРНК у складі різних віріонів представлена ??ланцюжками однієї полярності. (Scholtissek, Becht, 1971; Pons, 1971).

  Важливою властивістю РНК вірусу грипу є її фрагментарність. Ймовірно, велике число біологічних властивостей вірусу, які відрізняють його від більшості інших вірусів тварин, можуть 'бути пояснені на підставі цього факту. Хоча деякі віруси рослин, мабуть, мають фрагментарний геном, в даний 'час показано, що,. Крім вірусу грипу, фрагментовану РНК містять тільки рео-і онкорнавіруси1. В даний час фрагментарність геному вірусів грипу підтверджена фізичними, хімічними і біологічними методами.

  Седиментаційних аналіз міченої РНК, екстрагованої з очищених вірусних частинок, привів багатьох дослідників до незалежного висновку про те, що ця РНК має відносну молекулярну масу, занадто малу для 'кодування інформації, необхідної для синтезу вірус-специфічних поліпептидів (Davis, Barry, 1966; Duesberg , Robinson, 1967; Nayak, 1969; Pons, 1967a). У двох останніх роботах була описана ізоляція РНК з високою молекулярною масою (Agrawal, Bruening, 1966), однак, як зараз ясно, отримані результати, ймовірно, пов'язані з агрегацією фрагментів РНК або з наявністю неповністю депротеіні-знрованних молекул РНП. Аналіз вРНК, проведений Duesberg (1968), Pons і Hirst (1968а) за допомогою ПААГЕ, показав, що геном вірусу являє собою суму принаймні п'яти фрагментів РНК. Пізніше було виявлено, що вірусспеціфіческой донРНК, екстраговані з інфікованих клітин, також представляють собою суміш фрагментів, які після поділу на онРНК при плавленні мали ті ж електрофоретічесше рухливості, що і РНК, виділені з віріонів (Pons, Hirst, 1968). Ці факти підтвердили точку зору, що наявність фрагментів має біологічне значення і не пов'язано з простими деградаційних процесів під час виділення РНК-

  Наведені біохімічні експерименти показали, що вірусний геном фрагментарен. Існує також кілька біологічних фактів на користь цього висновку. Висока частота рекомбінації, отримана при генетичних скрещиваниях вірусів грипу, вказує на наявність механізму, схожого з випадковою пересортовування сегментів, а не на процес класичної генетичної рекомбінації з кросинговері між окремими видами РНК (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Scholtissek і Rott (1969) виявили, що байєр-139 (Вауег-139) інактивує властивості вірусу ступінчастим чином. Це вказує на наявність у вірусу мультікомпонент-ного гнома. Досліди по множинної реактивації (Hend, Liu, 1951; Barry, 1961) та ультрафіолетової інактивації (Joss et al., 1969; Gandi, Burke, 1970) були також інтерпретовані як можливий доказ існування мультикомпонентного геному.

  Хоча дані біохімічних і. Біологічних досліджень наводили на думку про існування фрагментарного генома, найбільш доказовими експериментами на користь цього припущення були наступні: Young і Content (1971) розділили за допомогою швидкісної седиментації в РНК на фрагменти трьох розмірів. Кожен з трьох класів фрагментів мав власним 5 'кінцем виду рррАр. Le-wandowski і співавт. (1971) показали, що так З'-кінці знаходиться нефосфорілірованний уридин (У-ОН). 'Крім того, Content і Duesberg (1971) виявили різницю в послідовності підстав у трьох різних за розмірами класів вРНК, a Horst і співавт. (1972) показали наявність різних олігонуклеотидів в кожному з названих фрагментів РНК.
трусы женские хлопок
 Ці дані, при обліку описаних раніше, дозволяють зробити висновок, що вкрай малоймовірно, або навіть неможливо, виникнення фрагментів РНК за рахунок розщеплення однієї ко-валентно безперервної однонитчатим молекули РНК

  Таким чином, ясно, що геном вірусу грипу фрагмент-тирован. Однак немає жодних доказів на користь того, що має місце зв'язок між окремими фрагментами, така, наприклад, як перекривання комплементарних (концов. Оскільки віруоспеціфіческая РНК,-ізольована з інфікованих клітин, також фрагментована, не зовсім ясно, яким чином при дозріванні вірусу до його складу включається потрібне число потрібних фрагментів РНК. Це питання буде обговорено у розділі V цієї глави.

  Б. РНК, ІЗОЛЬОВАНА ІЗ НЕПОВНОГО (ФОН-МАГНУСОВСКОГО) ВІРУСУ

  Одна з особливостей вірусу грипу полягає в тому, що при послідовних пасажах на курячих ембріонах або клітинних культурах при високій множинності зараження продукується знижене кількість інфекційного вірусу при збереженні високого титру гемаглютинації. Цей вірус з низькою інфекціонностио і високої гемагглютінірующімі-нього активністю називається неповним, або вірусом фон-Магнуса (von Magnus, 1954). Duesberg (1968) за допомогою методу ПААГЕ виявив, що неповний вірус має знижений вміст фрагментів РНК з великою молекулярною масою. Pons і Hirst (1969) показали, що після двох пасажів з високою множинністю зараження в неповному вірусі різко знижується вміст тільки самого великого за розмірами фрагмента РНК, тоді як лоллпептідний складу його змінюється лише кількісно. Необхідно відзначити, що хоча ми згадали про це найбільшому за молекулярною масою фрагменті як про «загубленому» в процесі формування неповного вірусу, не можна виключити можливість його присутності у фрагментованому вигляді. Це може статися, якщо РНК розщеплюється в одній або більшій кількості точок ланцюга. РНК в цьому випадку буде присутній в вирионе, але буде мігрувати в ПОЛПАК-ріламідном гелі в новому місці, а це може призвести до укладення про відсутність фрагмента у вірусному препараті. Проте в даний час немає експериментального докази цієї точки зору.

  Choppin (1969) виявив, що кілька послідовних пасажів вірусу грипу штаму WSN з високою множинністю зараження на клітинах MDBK не призводять до утворення помітних кількостей неповного вірусу. З іншого боку, один пасаж цього вірусу на клітинах HeLa призводить до продукції неінфекційних НА-частинок (Henle et al., 1955; Hillis et al., 1960; White et al., 1965; Ter Meulen, Love, 1967). Choppin і Pons (1970) досліджували РНК вірусів, вирощених на клітинах MDBK і HeLa, і виявили,,

  що для вірусу, вирощеного на клітинах MDBK, спостерігалося лише невелике зниження кількості самого великого за розмірами фрагмента РНК, і тільки після чотирьох послідовних пасажів з високою множинністю зараження його кількість знижувалося в значній мірі (на відміну від двох пасажів на курячих ембріонах і монослоях клітин CEF ). У клітинах HeLa одного пасажу вірусу, культивованих раніше на. Курячих ембріонах, було достатньо для елімінування самого 'високомолекулярного фрагмента РНК. Larner і Hodge (1969) визначили, що в клітинах HeLa, інфікованих вірусом грипу штаму PR8, синтезуються всі сім фрагментів днРНК. Однак ці автори не аналізували склад онРНК неповних вірусних частинок.

  Описані результати вказують на те, що клітина-господар відіграє значну роль в реплікації вірусної РНК, хоча природа цього впливу ще невідома. Неясний також механізм, згідно з яким окремий фрагмент РНК елімінується з віріона, хоча і було запропоновано наступне пояснення цього явища (Choppin, Pons, 1970). Оскільки реплікація менших за відносної молекулярної масі фрагментів РНК закінчується раніше, ніж реплікація великих фрагментів (Mills et al., 1967; Spigelman et al., 1968), надмірна кількість частинок вірусу грипу в клітині може призвести до виснаження пулу нуклеотидів або іншого хімічної сполуки ( інших хімічних сполук), необхідного для синтезу великих за розмірами молекул РНК-Ця гіпотеза про конкурентну реплікації малих фрагментів РНК виходить з припущення про незалежність синтезу кожного окремого фрагмента від синтезу інших фрагментів, а також з випадкового процесу пакування фрагментів РНК в вирион (Compans et al ., 1970). З тих пір як ця гіпотеза була сформульована, Bishop і співавт. (1972) показали, що кожен фрагмент РНК несе на собі свою власну молекулу полімерази. Це з'явилося аргументом на користь описаного механізму.

  IV. КОМПЛЕКС РНК з білками (РНП) А. ФІЗИЧНІ ТА ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ

  При руйнуванні віріонів грипу з допомогою ефіру (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Davenport et al., 1959), дезоксихолат натрію (Duesberg, 1969; Kingsbury, Webster, 1969) або нонідета P40 (NP40) (Ponsetal., 1969 ) вивільняється стабільний комплекс РНК з білком. Цей нуклеопро-теід (РНП) містить 10% РНК і 90% білка. Білкова компонента РНП має відносну молекулярну масу

  близько 55 000-65 000 і позначається символом NP (Pons et al., 1969). Швидкісне градієнтне центрифугування РНП в 10-35% гліцериновому градієнті з 'використанням буфера STEU дозволяє розділити РНП на три типи молекулярних комплексів з середніми коефіцієнтами седиментації 48, 40 і 34S (Pons, 1971). Duesberg (1969), а також Kingsbury і Webster (1969) теж ізолювали три класи різних за розмірами РНП, але з більш високими значеннями коефіцієнтів седиментації-приблизно 70, 60 і 50S. Різниця в наведених значеннях коефіцієнтів седиментації, ймовірно, пов'язана з розходженням методів ізоляції та аналізу РНП, який має тенденцію IK агрегації в відсутність сечовини або в розчинах з низькою концентрацією солей. Після фіксації РНП за допомогою глютаральдегіду його плавуча щільність у хлориде цезію дорівнює 1,34 г/см3 (Krug, 1971).

  Pons (1971), використовуючи аналіз ізольованого РНП за допомогою ПААГЕ, довів припущення Duesberg (3969), Kingsbury і Webster (1969) про те, що кожен з різних за відносної 'молекулярної масі фрагментів РНП, ізольованих за допомогою центрифугування в градієнті щільності, являє собою комплекс різних за розмірами молекул РНК з білком NP. В даний врехмя немає доказів існування єдиного ланцюжка РНП (структура, в якій фрагменти РНК утримуються на безперервного ланцюга субодиниць NP) як в вірмоне, так і в інфікованій клітині.

  На відміну від РНП парамиксовирусов (Compans, Choppin, 1967) РНП вірусу грипу чутливий до дії РНК-ази (Duesberg, 1969; Pons et al., 1969). Обробка РНП проказою призводить до розщеплення-білка NP і до вивільнення вірусної РНК (Pons et al., 1969). Мяша (я обробка проназа не викликає деградації білка NP (Duesberg, 1969). Наведені експериментальні дані вказують на стеріче-окую доступність як 'білка, так і РНК, що входять до РНП-комплекс, хоча кожна із складових частин РНП і екранує пов'язану з нею макромолекулу.

  Pons і співавт. (1969) провели електронно-мікроскопічне вивчення ізольованого РНП, відтіняючи його за допомогою укранілацетата або негативно контрастуючи його фосфоволь-Фраматом калію. Спостережувані структури мали спіральні або обкручені торцеві перетину з протилежний спрямованими глибокої та дрібної борозенками і з петлями на кожному з кінців. Ці структури-були різної довжини: в межах від 50 до 150 нм і постійної товщини: 15 ям (7,5 нм для кінцевих петель) (Schuize et al., 1970) (29, A). Corn-pans і співавт. (1972) отримали аналогічні результати і показали, що довжина кожного з фрагментів РНП відображає

  довжину молекули РНК, що входить до його складу. Морфологічно РНП являє собою комплекс, що складається з РНК і білка, закручений сам на себе з утворенням високо-спіральної структури, причому ні РНК, ні білок не є чохлом для іншої макромолекули, що входить до складу рибонуклеопротеидов.

  Scholtissek і Becht (1971) показали, що білок NP має однакове спорідненість до вРНК і> до вкРНК-Він також приєднувався до клітинних РНК, що містить у великій кількості АМФ, і до інших одноцепо'чечним РНК. З двунитчатую-ми РНК білок не взаємодіяв. Як 'було зазначено, РН'П-комплеке стабільний у 1 М мочевине, а також в 0,8 М Nad або в 1 М КС1. В умовах in vitro, мабуть, немає високої специфічності у взаємодії між молекулами білка NP і РНК-Іншого роду вказівка ??про втрату специфічності 'було проведено в дослідженнях Pons і співавт. (1969), Goldstein і Pons (1970). Як показали ці автори полівінілсульфат (PVS) витісняє РНК з білкового остова, що-призводить до виникнення комплексу PVS-NP, який мав седиментаційні властивості і морфологію, подібну з вихідним РНП (29, .6). Вільна вірусна РНК, се-діментірующая при 18S, була чутлива до розщеплення РНК-азой, як це спостерігається для РНК, виділеної за допомогою фенольного методу, в той час як комплекс PVS-NP був нечутливий до дії РНК-ази. Результати описаних експериментів вказують на те, що морфологія РНП в основному визначається взаємодією між молекулами NP. Дійсно, комплекс має подібну структуру незалежно від того, зв'язується Чи молекулуа NP з РНК або з різко відмінною від неї (Молекулою PVS. Крім того,. Комплекс PVS-NP, ідентичний фізично і морфологічно РНП, може бути отриманий тільки в разі, коли PVS додається до ннтактному РНП. Додавання PVS до вільних субодиницям NP призводить до виникнення гетерогенної суміші молекул (комплексу PVS-білок, який не сходить з РНП ні в еедіментаціонном, ні в морфологічному відношенні. Взаємодія PVS з РНП також вказує на те, що, як . було відзначено Schulze (1973), у формуванні РНП грають роль в основному зарядові взаємодії між молекулами білка і фоофоефіряого остова РНК, оскільки РНК може бути замінена полімером, що містить у своєму складі заряджені фосфатні групи.

  Для ізоляції РНП з інфікованих клітин 'було розроблено декілька різних методів (Pons, 1971, 1972). При використанні будь-якого з них виділявся РНП, плавуча щільність, коефіцієнт седиментації та морфологічні характеристики якого були ідентичні характеристикам ві-Ріоні РНП. Малося тільки одна різниця між РНП, виділеними з віріонів і з інфікованих клітин: ви-Ріоні РНП складався з білка, що знаходиться в комплексі тільки з вРНК, в той час як 90% клітинного РНП містило вРНК, а 10% - BIKPIHK. На відміну від Krug (1972), який виявив вільну BIKPHK В інфікованих. Клітинах, ми не виявили вільної вирусспецифической РНК в клітині (крім днРНК). Наш метод виділення давав нам всю внутрішньоклітинну вірусспеціфічеокую РНК у вигляді РНП. Причини наведеного відмінності в результатах поки неясні.

  Б. БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ РНП

  До цих пір немає докази того, що білкова частина РНП грає яку-небудь іншу роль, крім здійснення функції захисного чохла для РНК. Можливо, що сегменти

  РНК можуть бути пов'язані в єдиний ланцюг на безперервному остові NP-білка. Хоча такого роду структура і не виявлялася, проте була запропонована модель реплікації РНК, що припускає її існування (Pons, 1970). Крім того, білок NP або сам РНП може володіти деякою регуляторної функцією при транскрипції, трансляції або реплікації. Відповіді на ці питання можуть бути знайдені в процесі вивчення транскрипції і трансляції в системі in vitro.

  Hir'st і Pons (1972) виявили, що вірусні екстракти, що містять РНП штаму вірусу грипу дикого типу (WSN), мали більш високу відновлює активність (marker rescue) в дослідах з температурочувствітельной-ми мутантами. Природа і будова речовини, що викликає ефект. Відновлення, неясна, проте вільна вірусна * РНК, виділена з віріони РНП за допомогою суміші фенол-SDS або при обробці його лолівівідеульфатом, була: повністю неактивна в цьому відношенні. Чи істотно для: відновлювальних властивостей препарату присутність у системі: тільки білка NP або суміші цього білка з полімеразою - ще не ясно.

  V. Внутрішньоклітинні вірусспеціфіческой РНК

  А. віріони РНК

  1. Синтез вРНК

  Незважаючи на те що до теперішнього часу було виконано велику кількість робіт, присвячених вивченню синтезу РНК 'вірусу грипу в клітині-хазяїні, інтерпретація їх результатів була ускладнена внаслідок того, що вірусна реплікація інгібованими у присутності актиноміцину D (AD). Деякі автори (інтерпретують свої результати, вважаючи, що синтез вірусної РНК стає нечутливим до AD через 2-27г ч після початку інфекції (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964; Kingsbury, 1970; Blair, Duesberg , 1970). Проте є інша точка зору, згідно з якою AD володіє інгібуючим дією незалежно від часу його введення в систему (Scholtissek, Rott, 1970; Gregoriades, 1970; Pons, 1973). Ці роботи будуть детально обговорені в розділі VIA . Ми: підняли тут це питання тільки для того, щоб підкреслити той факт, що дослідження, про які буде сказано далі, в основному були виконані без застосування будь-яких інгібіторів синтезу вірусної РНК і у зв'язку з цим зажадали значних зусиль для розділення вірусспепіфіческіх продуктів і продуктів клітини-хазяїна в процесі дозрівання вірусу.

  Як зазначалося у розділі ПВ, 1 вірусспеціфіческой РНК мають середнє значення 'коефіцієнта седиментації, рівне 18S. Рібоеомалиние РНК клітин-господарів ссавців седіментіруют при 28 і 18S. Таким чином, при використанні інгібіторів синтезу рибосомальної РНК клітини-хазяїна важко зробити якісь висновки про синтез вірусної РНК. у зв'язку з тим, що 18S РНК входить до складу як вірусу, так і клепки-господаря. Для подолання цієї труднощі був розроблений метод виділення з клітини вірусних РНК у вигляді РНП. Р'ібонуклеопротеід має середній коефіцієнт седиментації 30-50S, стабільний у присутності ЕДТА, високих концентрацій солей і сечовини (ці види обробки руйнують рибосоми клітини-господаря) і може бути сконцентрований осадженням в ізоелектричної точці (Schafer, Munk, 1952). Використовуючи ці властивості РНП, для його ізоляції інфіковані клітини руйнують за допомогою NP-40, РНП витягують і концентрують за допомогою преципітації в 0,1 М ацетатному буфері рН 4,5 і очищають швидкісним центрифугуванням 1-2 рази через гліцериновий градієнт (Pons, 1971 ). Ізольований і очищений таким способом РНП має плавучу щільність, седиментаційні характеристики і морфологію віріонів РНП. Однак у той час як вРНК не володіє здатністю ж самогібрідізаціі, до 20% РНК, виділеної з внутрішньоклітинного РНП, самогібрідізуется. Ці дані спільно з даними конкурентної самогібрідізаціі вказують на те, що внутрішньоклітинний РНП містить 90% вРНК і 10% вкРНК (Pons, 1971).

  Scholtissek і співавт. (1969) повідомили, що синтез вірусної РНК пов'язаний з синтезом поліпептиду NP. Цей факт дозволяє вивчати кінетику синтезу вірусної РНК по виникненню в клітці РНП. Крім того, використання методів, розроблених для вивчення внутрішньоклітинного синтезу в процесі клітинної реплікації, 'дозволило висловити точку зору, що в клітці немає вільних віруослеціфіческіх РНК (Pons, 1971, 1972). Це означає, що, як тільки відбувається синтез ланцюга РНК (або навіть під час самого синтезу), вона асоціюється з молекулами 'білка NP. Krug (1971), однак, інтерпретував отримані ним дані на основі. Припущення про те, що синтез вкРНК відбувається набагато раніше, ніж освіта вкРНП. Незважаючи на це невідповідність точок зору, мабуть, все ж є правомочним розглядати синтез РНП як критерій синтезу РНК. Pons (1971) показав, що РНП можна виявити вже через 1 год після початку інфекції. Раніше було виявлено, що вірус-специфічна днРНК може бути, знайдена в клітці потому

  '/ Г ч після початку інфекції (Pons, 1967b). Це розходження можна пояснити просто методологічними труднощами екстраполяції кривої синтезу РНП в початковій точці відліку часу. Кінетика синтезу РНП має всі риси, характерні для синтезу самореплицирующихся молекул (Pons, 1971).

  На закінчення слід зазначити, що отримані дані вказують на те, що синтез вірусної РНК, спостережуваний по виникненню РНП, починається майже відразу ж після початку інфекції. Асимптотична поведінка кривої кінетики накопичення РНП вказує на наявність самодулліцірующіхся молекул. У разі використання монослоев клітин курячих фібробластів синтез РНП починається максимум через 4-5 год після інфекції, коли в позаклітинній рідині виявляються знову синтезовані вірусні частки, і деякі кленкі деградують. Інший аспект проблеми внутрішньоклітинного синтезу вірусної РНК полягає в тому, де синтезується ця РНК-Це питання буде розглянуто в гол. 8.

  2, Дозрівання і упаковка РНК в віріони

  Механізм, за яким РНК (або РНП) упаковується в вірусну частку, до теперішнього часу невідомий. Ясно, що має місце процес відбору, в результаті якого у знову формовані вірусні частки включаються тільки РНП, що містять молекули вРНК (але не вкРНК). Можна припустити, хоча в даний час і немає прямих доказів цього твердження, що на ранніх етапах дозрівання віріонів в збірці беруть участь якісь полімерні молекули (ймовірно,. Молекули М-білка), що містять місця для «пізнавання» вРНК-Якщо такий ініціатор- ний механізм має місце, то молекули інших поліпептидів або субодиниці того ж білка конденсуються навколо РНП і починається процес самозбірки, який закінчується отпочкованием цільних вірусних частинок від тих специфічних ділянок клітинних мембран, які раніше зазнали змін і містять вірусні компоненти.

  З'ясування питання про те, як повний набір фрагментів вірусної PiHK (у вигляді РНП) упаковується в отдельную1 вірусну частку,-складне завдання, особливо при обліку фрагментарності вірусного генома. Хоча ми і не можемо виключити можливість «вибудовування» фрагментів РНК або зв'язування їх впорядкованим чином на безперервному білковому остові, в даний час немає достатніх доказів цього твердження. Compans і співавт. (1970) розрахували, що якщо для формування повного вірусного генома потрібно 5 фрагментів і якщо насправді упаковується випадковим чином 7 фрагментів, близько 22% вірусних часток будуть містити повний набір з п'яти необ-

  дімих фрагментів РНП. В даний-час виявлено, що в кожному вирионе міститься по. Принаймні шість чи сім фрагментів. Таким чином, якщо визнати правильною наведену схему, необхідно припустити, що в процесі упаковки в кожну вірусну частку повинно лопать 9-10 фрагментів РНП. Хоча це і трохи завищена величина, якщо грунтуватися на даних хімічного аналізу вмісту РНК в одній вірусної частці, цю можливість не можна виключити. Такий механізм дозрівання разом зі здатністю віріонів ж агрегації і збільшення за рахунок цього своєї інфекційне ™ (Hirst, Pons, 1973) дає вірусу грипу переваги в боротьбі за існування в природі. Один експериментальний підхід до даного питання вкрай корисний, але на практиці він дуже складний в технічному відношенні. Якщо припустити, що реплікація фрагментів РНП здійснюється випадково, можна очікувати наступне. Випадковий, або невпорядкований, синтез фрагментів РНП повинен привести до надлишкової продукції менших за розмірами фрагментів. Це припущення грунтується на тому, що молекула полімерази кожного фрагмента РНП (Bishop et al.
 , 1972) реплицирует РНК з однаковою швидкістю. Внаслідок цього найменший за розмірами фрагмент РНП, довжина (якого становить 7з довжини найбільшого з фрагментів, буде реплицироваться в 3 рази більшій кількості. Отримані нами дані не підтверджують це припущення Bishop і співавт. (1972). Співвідношення між кількістю різних фрагментів 'дорівнювало 2:1:1:1:2 - від самого. великого за розмірами фрагмента до самого малому (Pons, неопубліковані дані). Звідси можна зробити висновок, що, хоча яри формуванні зрілих віріонів фрагменти вирусспецифических РНК «можуть включатися в вірусну частку випадково, їх реплікація або транскрипція якимось чином регулюється чи контролюється. Якщо включення фрагментів РНП в вірлон підпорядковується законам випадкових процесів, то їх відносний розподіл має бути однаковим як при виділенні з віріонів, так і при ізоляції з внутрішньоклітинного пулу. Попередньо отримані дані були неоднозначні в зв'язку з великими технічними труднощами при постановці дослідів, що полягають в присутності в популяції неповного вірусу і відсутності синхронності інфекційного процесу в різних клітинах.

  Б. комплементарними АБО ІНФОРМАЦІЙНА РНК {вкРНК)

  1. Внутрішньоклітинна локалізація вкРНК

  Було показано, що РНК, комплементарна вРНК, асоційована в інфікованих клітинах з полісоми (Pons, 1972). Встановлено (див. розділ Va, 1), що 10% внутріклеточ-

  ної вірусспеціфічеокой РНК, изолируемой у вигляді РНП, являє собою вкРНК. Однак після фракціонування клітин було виявлено, що більша частина вірусспеціфі-чеський РНК, асоційованої з лоліоомамі, була представлена ??вкРНК (Pons, 1972). Нещодавно Etkind і Krug (1974) повідомили, що вся поліеомная РНК являє собою вкРНК. Цей висновок не узгоджується з нашими даними, оскільки в нашій роботі ми змушені були використовувати корекцію для обліку вкладу РНК клітини-хазяїна. Etkind м Krug (1974) провели ретельне видалення всіх Контаміна-рующих РНК клітини. Мабуть, вірус грипу. Подібний до інших вірусів, що містять у складі своїх віріонів РНК-залежну PiHK-лолімеразу (наприклад, вірус везикулярного стоматиту), і в зв'язку з цим здатний до синтезу функціональної інформаційної РНК через короткий час після початку інфекційного процесу.

  Іншого роду експериментальний підхід дозволив підлозі

  чить дані, інтерпретація (Яких може призвести до за

  ключении про те, що природа інформаційної РНК відмінна

  від тієї, про яку говорилося раніше. Ці дані вкрай про

  тіворечіви н в даний час можуть розглядатися

  лише як попередні. Siegert і співавт. (1973) повідомили

  про синтез поліпептиду NP в Е. coli бесклеточной белоксінте-

  зірующей системі при використанні як інформа

  ційної РНК 'вРНК. Kingsbury і Webster (1973) отримали

  прямо протилежні результати, виявивши, що вРНК

  не може виступати в якості інформаційної в бесклеточ

  ної системі ретикулоцитів кролика. (В той же час, за їх

  даними, РНК, ізольована з інфікованих клітин

  (Суміш вРНК і вкРНК), виступала як іРНК, і її присутст

  віє в системі призводило до синтезу М-білка. На основі цих

  прямо протилежних результатів важко виробити (ком

  проміссную точку зору, проте, враховуючи попередній

  характер повідомлень, до появи результатів, подтвержда

  чих той чи інший результат, можна з обережністю пред

  покласти, що один з фрагментів вРНК-може виступати

  в якості інформаційної РНК. Дані по самогібріді

  зації, отримані Etkind і Krug (1974), а також Pons

  (1972), виключають наявність 'більше ніж одного фрагмента

  вРНК, службовця матрицею як в транскрипції, так і в

  трансляції.

  2. Кінетика синтезу вкРНК

  Роботи з вивчення синтезу РНП і днРНК, описані

  раніше, показали, що синтез вкРНК починається дуже скоро

  * Після початку інфекції. Більш об'єктивне вивчення синтезу

  саме цього типу РНК може бути проведено шляхом дослі-

  давания появи вкРНК на полісомах. Кльоші мітять протягом короткого інтервалу пульсової міткою [3Н]-уридин в різні моменти після початку інфекції, і полісоми виділяють і аналізують. Після екстракції за допомогою суміші фенолхлороформ-SDS. Отримані результати показали, що після початкового періоду гноблення формування полісом клітин-господарів синтез вкРНК безперервно зростає. Основна кількість вкРНК синтезується через 2 '/ г-3 год після початку інфекції, після чого швидкість її синтезу знижується (Pons, у пресі). Аналогічні дані привели Krug і Et-kind (1973), які вивчали синтез РНК: в цитоплазмі і ядрах інфікованих клітин. Ці автори показали, що синтез вкРНК закінчується через 4 год після початку інфекції. Таким чином, наведені дані вказують на те, що синтез вкРНК починається відразу ж після початку інфекції і закінчується через 4 ч. Через цей час знову синтезовані вірусні частки виявляються поза клітини. Природа такого «відсікаючого» механізму в даний час невідома.

  3. Фізичні властивості інформаційної РНК (мРНК)

  При вивченні вкРНК, асоційованої з полісоми (мРНК), виявлено, що основна кількість, якщо не вся мРНК, знаходиться> у вигляді РНП. Полісоми ізолювали, руйнували високою концентрацією солі, ЕДТА і пуромицина (Blobel, 1971), і отриману таким чином мРНК піддавали аналізу. Менше 2% вкРНК знаходилося у вільному вигляді, що залишилися 98% становив РНП. Великі заходи було вжито для того, щоб переконатися, що поліпептид NP (єдиний яоліпептід, асоційований з ізольованою мРНК) неспецифически НЕ адсорбується на вільну мРНК в процесі самої ізоляції. Важко переконатися в тому, що МРНП являє собою «безперервний» РНП, тобто не має ділянок, вільних від білка, проте, грунтуючись на седікентаціонних характеристиках ізольованого МРНП і його плавучої щільності в CsCl, можна зробити висновок, що, мабуть , за своїми фізичними властивостями МРНП ідентичний віріони.

  Велике число дослідників висловлювали точку зору, що мРНК ссавців існує і функціонує як іРНК у вигляді РНП (Spirin, Nemer, 1965; Spirin, 1966; Perry, Kelley, 1968; Henshaw, 1968; Kumar, Lindber, 1972; Bryan, Hayashi, 1973 ; Gross, 1968; Spirin, 1969). Ясно, що МРНП, будучи більш стійким до розщеплюється дії РНК-аз, буде більш стабільний, ніж вільна мРНК. Проте не зовсім ясно, як транслюється така молекула. Мабуть, цей процес повинен включати дисоціацію субодиниць по-

  ліпелтіда з РНК в місці контакту рибосоми з мРНК. Можливо також, що полипептидная частина комплексу грає ре-гуляторного роль в процесі трансляції. Повне рішення всіх цих проблем буде можливо лише при дослідженні белоксінтезірующіх систем.

  VI. ДІЯ ІНГІБІТОРІВ НА СИНТЕЗ РНК

  Л. Актіноміцини D

  Раніше ми вже вказували (див. раздел1 VA, 1), що AD повністю інгібує синтез вкРНК незалежно від того, на якому етапі реплікативного циклу він вводиться в систему, і лише в малому ступені пригнічує синтез вРНК (Scholtissek, Rott, 1970; Pons , 1973). За даними Gregoriades (1970), вкРНК, синтезована до початку інгібування її синтезу, продовжує функціонувати як іРНК протягом принаймні 17 год після додавання AD. Як встановлено в даний час, мабуть, інтерпретація даних була прямо протилежна у дослідників, що стоять на точці зору, що AD взагалі не володіє інгібіторної властивостями, якщо його додають через 2-3 год після початку інфекції (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964), і тих, хто вважає AD здатним володіти інгібітор-ним ефектом при додаванні його в будь-який час (Pons, 1967b; Scholtissek, Rott, 1970). Істина, мабуть, лежить десь між цими двома точками зору. Актиноміцин D інгібує синтез вкРНК незалежно від моменту появи його в клітці, зокрема, якщо AD додають до моменту, коли в клітці вже синтезувалося велике число молекул мРНК-Саме це є причиною зниження швидкості синтезу вірусних поліпептидів. Якщо ж AD додають після того, як уже синтезувалося значна кількість молекул вкРНК, і цієї кількості достатньо для виробництва поліпелтідних молекул і для того, щоб на них, як на матриці, синтезувалися молекули вРНК, то синтез вірусних частинок проходитиме з нормальною швидкістю.

  Таким чином, починаючи з цього моменту, AD проявляє себе як безінгібіторное речовину. Необхідно підкреслити, однак, що AD є інгібітором синтезу вкРНК і повинен використовуватися з обережністю при вивченні синтезу внутрішньоклітинних макромолекул.

  Природа інгібіторної дії AD на синтез IBKPHK В даний час неясна, оскільки AD ефективний при введенні в «летку до початку інфекції. Цілком можливо, що AD пригнічує якийсь клітинний механізм, необхідний для синтезу вкРНК. Це означає, що функціональна хазяйська ДНК, але не її синтез (Burry, 1964), необхідна для

  репродукції вірусу. AD не пригнічує синтез вкРНК in vitro (Chow, Simpson, 1971), во, як не дивно,, пригнічує внутрішньоклітинну транскрипцію (Bean, Simpson, 1973). Можна зробити висновок, що AD інгібує синтез якогось клітинного фактора (або факторів), необхідного для процесу транскрипції. Цей фактор відсутній в системі in vitro, і, хоча деякий синтез вкРНК і відбувається, цей процес може значною мірою стимулюватися додаванням клітинного фактора (Rochovansky, персональне повідомлення).

  Роботі з дослідження синтезу РНК вірусу грипу заважала неможливість провести експерименти лульс-чейза на монослоях клітин курячих фібробластів; клітини продовжували включати мічений уридин навіть у присутності великого надлишку немічених нуклеинового підстави. Нещодавно AD використовували для блокування включення міченого уридину в вкРНК, асоційовану з полісоми. Хоча це не 'був «чейз» в правильному значенні цього слова, така обробка дозволила простежити долю предсуществующей вкРНК. Було показано, що після того, (як вкРНК 'була ізольована з інфікованих клітин після короткої пульсової експозиції (30 хв) міченим підставою, велика частина РНК седіментіро'вала в області 14S. При збільшенні часу експозиції коефіцієнт седиментації збільшувався, поки при експозиції Р / г год не досягав середньої величини 18S і розподілу, характерного для вРНК-

  При обробці клітин пульсової міткою протягом 30 хв і додаванні потім AD в різний час за відсутності мітки був показаний деяке зрушення в розподілі міченої РНК при її швидкісному седиментационном аналізі. Безпосередньо після дії мітки приблизно 70% міченої вкРНК спостерігали в області 9-15S і 30%-в області 15 - - 22S (РНК, екстрагована з віріонів, мала наступний розподіл: 20% в області 9-15S і 80% в області 15 - 22S). Наприкінці 30-хвилинного періоду експозиції міткою ізотоп прибирали, додавали AD і аліквоти суспензії клітин відбирали кожні 30 хв. Після 60-хвилинної експозиції з AD (при збільшенні експозиції подальших змін не спостерігалося) мітка розподілялася таким чином: 40% в області 9-15S і 60% в області 15-22S; ці величини знаходяться між величинами, характерними для вРНК і вкРНК наприкінці 30-хвилинного дії пульсової мітки. Важливо те, що значне збільшення включеної мітки в 15 - 22S РНК не обумовлено збільшенням кількості цієї РНК, а пов'язане із зменшенням кількості 9-15S РНК-Ці результати можуть бути інтерпретовані з урахуванням того, що AD, як і було раніше припущено, інгібує синтез вкРНК. Однак зменшення кількості менших за розмірами фрагментів вкРНК може означати не те, що РНК яа-

  ходятся в надмірній кількості, а скоріше те, що має місце наявність неповних молекул РНК великої молекулярної маси. При припиненні їх синтезу за допомогою AD ці знаходяться в стані зростання молекули дисоціюють з полісом, а в асоційованому з полісоми стані залишаються тільки закінчивши свій синтез молекули вкРНК, і вони мають те ж відносний розподіл по РНК-фрагментам, що і РНК, ізольована з віріонів .

  Ці експерименти були описані тут так-докладно для того, щоб прояснити кілька важливих для синтезу вкРНК фактів, © o-перше, нерівномірний розподіл молекул вкРНК після відносно короткої пульсової експозиції міткою обумовлене швидше присутністю незакінч свій синтез молекул РНК, а не надмірним вмістом малих за розмірами молекул. Як вже було зазначено в розділі VA, 2, якщо редулліцірованіе вкРНК випадково і неконтрольовано, то можна виявити набагато більше малих, ніж великих, фрагментів РНК-Оскільки такал ситуація не спостерігається IB експерименті, повинен мати місце механізм контролю, що визначає кількість синтезирующихся фрагментів даного розміру . По-друге, оскільки були виявлені неповністю закінчивши свій синтез молекули РНК (у вигляді РНП), асоційовані з полісоми, або транскрипція вкРНК відбувається на ланцюжку субодиниць поліпептиду NP, або цей білок асоціює з ще неповної ланцюгом РНК-Цей механізм відмінний від механізму, згідно яким спочатку синтезується повна молекула РНК, а потім вона лротеінізіруетея. Крім того, у зв'язку з тим що ці неповні молекули відокремлюються від полісом, можна укласти, що трансляція вкРНК має місце тоді, коли ланцюг ще синтезується. Така ситуація спостерігається в більшості досліджених бактеріальних систем.

  Б. циклогексаміду

  Циклогексимид інгібує синтез білків за рахунок припинення подовження поліпептидного ланцюга (Wettstein et al., 1964; Stanners, 1966; Watanabe et al., 1967). Обробка клітин, інфікованих вірусом грипу, циклогексаміду знижує синтез вкРНК і повністю блокує синтез вРНК (Pons, 1973). Ці результати узгоджуються з результатами Scholtis-sek і Rott (1970), що вивчають сумарні клітинні екстракти за допомогою методу самогібрідізаціі.

  Природа інгібіторного ефекту циклогексаміду ще неясна. Різна чутливість синтезу вРНК та синтезу вкРНК до дії циклогексаміду і AD вказує на те, що в синтезі беруть участь два різних ферменту (або якщо не два ферменту, то одна ферментна система з

  різними субодиницями, які можуть бути представлені - поляпептвдамі як клітини-господаря, так і вірусспеці-фічеакімі), синтез яких чутливий до присутності зазначених інгібіторів.

  В. КОРДІСЕПІН

  Кордісепін, будучи інгібітором синтезу Лоли-А послідовності (Penman et al., 1970; Darnell et al., 1971), може грати, як 'було встановлено на великому числі вірусних і клітинних систем, важливу роль IB синтезі функціональних інформаційних РНК-Клітини ( CEF або ВНК-21) інфікували вірусом грипу, обробляли кордіселіном протягом 45 хв у проміжку між 2 і 4 год після початку інфекції, а потім мітили [3Н]-уридин протягом 30 хв. З клітин акстрагіровалі полісоми і РНП і порівнювали з полісоми і РНП необроблених інфікованих і контрольних клітин. У інфікованих клітинах кордісепін викликав 70% інгібування включення мітки як в полісі-ми, так і в РНП і 60% інгібування титру гемаотлютіна-ції і виходу інфекційного вірусу. Включення мітки в полісоми неінфікованих клітин CEF інгабіровалось приблизно на 80%. У клепках ВНК-21 кордісепін не впливав на титр гемаглютинації і інфекційність вірусу, інгібі-рова синтез полісом і РНП лише в малому ступені, однак ингибировал включення мітки в полісоми неінфікованих клітин на 86% (Rochovansky, Pons, 1975).

  За даними Etkin і Krug (1974), в мРНК вірусу грипу присутні Лоли-А ділянки. Оскільки вРНК не містить у своєму складі комплементарних полі-У фрагментів (Marshall, Gallespie, 1972; Rochovansky, Pons, 1975), ділянка Лоли-А, виявляється в молекулі вкРНК, повинен приєднуватися вже після закінчення процесу транскрипції. Ясно, що клітини CEF, які мають відносно невисокою метаболічної активністю, при наших умовах експерименту [але які більш активні в системі Mahy і співавт. (1973), де кордісепін слабо впливає на продукування ві-Ріоні штаму FPV в клітинах CEF] можуть бути змушені синтезувати деякі клітинні структури, такі, як Лоли-А, перш ніж продовжити вірусну реплікацію. Клітини ж ВНК-21 більш активні в метаболічному відношенні і тому можуть содержать'более обширний резервуар компонентів клітин-господарів, необхідних для синтезу вірусу. Твердження про те, що в деяких випадках синтез клітин потрібно для продукції вірусу, підтверджується даними роботи Mahy і співавт. (1972), в якій показано стимулювання синтезу вірусу FPV в клітці CEF ДНК-залежної РНК-полімеразою П. РНК-полімераза II є ферментом, який бере участь у синтезі клітинної мРНК-

  VII. ВИСНОВОК

  З наведеного 'Обговорення хімічних, біологічних і морфологічних властивостей РНК і РНП віріонів грипу ясно, що геном цього вірусу складається з декількох фрагментів однонитчатим РНК. Аналіз кінцевих груп різних фрагментів РНК і наявність у складі кожного фрагмента молекул полімерази робить цілком. Вірогідною індивідуальну реплікацію кожного фрагмента. Проте менш зрозуміле питання, як потрібне число фрагментів потрібного типу упаковується при формуванні інфекційної вірусної частинки. Чи знаходиться процес відбору фрагментів під контролем якогось регуляторного механізму або відбувається випадково? За рахунок чого в процесі цього відбору виключається молекула вкРНК? Відповіді на ці питання шукають в даний час в кількох лабораторіях.

  З цими проблема1мі пов'язані також питання регуляції транскрипції, трансляції та реплікації РНК в інфікованих вірусом клітинах. Про ці процеси відомо дуже мало, хоча вони і є об'єктом 'Багатьох досліджень. Деякі відповіді на підняті тут питання будуть, по всій ймовірності, отримані при використанні in 'vitro РНК-і белоксінтезірующіх систем.



  ЛІТЕРАТУРА

  Ada G. L., Perry В. Т. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1954, v. 32, p. 453.

  Ada G. L., Perry B. T. J. gen. Microbiol., 1956, v. 14, p. 623. Agrawal H. O., Bruening G. Proc. nat. Acad. Sci. U. S.; 1966, v. 55, p. 818. Barry R. D. Virology, 1961, v. 14, p. 398.

  Barry R. D. Cell. biol. Myxovirus Infect., Ciba Found. Symp., 1964, p. SIBarry R. D., Ives D. R., Cruickshank J. G. Nature (London), 1962

  Bean W. J., Simpson R. W. Virology, 1973, v, 56, p. 646. Bishop D. H., Roy P., Bean W. J., Jr., Simpson R. W. J. Virol., 1972

  Blair З D., Duesberg P. H. Ann, rev. Microbiol., 1970, v. 24, p. 539. Blobel G. Proc. nat. Acad. Sci. U. S., 1971, v. 68, p. 832.

  Bryan R. N.. Hayashi M. Nature (London), New Biol., 1973, v. 244, p. 271. Burnet F. M., Science, 1956, v. 123, p. 1101. Choppin P. W. Virology, 1969, v. 39, p. 130. Choppin P. W., Pons M. W. Virology, 1970, v. 42, p. 603. Chow N.. Simpson R. W. Proc. nat. Acad. Sci. U. S., 1971, v. 68, p. 752. Compans R. W., Choppin P. W. Proc. nat. Acad. Sci. U. S., 1967

  Compans R. W., Content J., Duesberg P. H. J. Virol., 1972, v. 10, 'p. 795. Compans R. W., Dimmock N. J., Meier-Ewert H. In: The Biology of Large

  RNA Viruses (RD Barry and BWJ Mahy, eds.), New York, Acad.

  Content J., Duesberg P. H. J. mol. Biol., 1971, v. 62, p. 273. Darnell J. E., Philipson, L., Wall R., Adesnik M. Science, 1971,. v. 174 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Рибонуклеїнові кислоти вірусів грипу"
  1.  Кільбурн Е.Д.. Віруси грипу та грип (1978), 1978
      Книга присвячена огляду різноманітних вірусів грипу, їх культивування, біохімії і особливостям молекулярного пристрою. Зміст: Віруси грипу та грип. Структура вірусу грипу. Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін. Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу. РНК вірусів
  2.  Вірус сказу ТА ІНШІ рабдовирусами
      Лоуренс Корі (Lawrence Corey) Сказ Сказ являє собою остропротекающая вірусну хворобу ссавців, що характеризується ураженням центральної нервової системи та передающуюся з інфікованим секретом, зазвичай слиною. Найчастіше зараження сказом відбувається під час укусу інфікованої тварини, проте в ряді випадків воно може відбутися при попаданні в організм
  3.  Мікоплазменної інфекція
      Уоллес А. Клайд, молодший (Wallace A. Clyde, lr.) 'Мікоплазми, раніше звані pleuropneumonia-like organisms (PPLO), викликають розвиток висококонтагіозна форми пневмонії та плевриту у биків. В даний час мікоплазми зараховані до класу Mollicutes, що складається з трьох сімейств і чотирьох пологів. Мікоплазма, яка обумовлює інфекції дихальних шляхів у людини - М. pneumoniae, інші -
  4.  Генетичний компонент вірусу - РНК або ДНК
      Клітини всіх живих організмів містять два види нуклеїнової кислоти - ДНК (двунітевая ДНК клітинного генома) і РНК (мРНК, тРНК, рРНК, відповідно матрична, транспортна та рибосомальная РНК). На початку 1940-х років стало більш-менш ясно, що віруси також містять нуклеїнові кислоти. Однак, на відміну від клітин, віріони вірусів містять тільки один вид нуклеїнової кислоти - або ДНК або
  5.  Реалізація генетичної інформації вірусів
      При здійсненні життєвого циклу РНК-геномні і ДНК-геномні віруси реалізують різні молекулярні механізми і стратегії. У зв'язку з цим особливості реплікації цих геномів і їх експресії будуть розглянуті окремо. 3.2.1 Генетичні стратегії РНК-геномних вірусів 3.2.1.1 Основні принципи і механізми реплікації РНК-геномів
  6.  Інгібування клітинної транскрипції
      Апарат транскрипції господаря представляє логічну мету для інгібування більшістю РНК-вірусів, включаючи віруси, реплікується в цитоплазмі і не потребують факторів транскрипції господаря. Віруси грипу є винятком, так як вони реплікуються в ядрі клітини-господаря і вимагають синтезованих знову транскриптов господаря для отримання кепірованних
  7.  Загальні поняття про віруси
      Вірусологія - одна з основних біологічних наук. Займається вивченням вірусів. Віруси - це організми, не здатні існувати і розмножуватися самостійно. У визначенні вірусу підкреслюється особлива природа їх паразитизму, який можна назвати паразитизмом на генетичному рівні. Той факт, що віруси здатні виживати і розмножуватися тільки усередині інших клітин, пояснюється не відсутністю
  8. Г
      + + + Габітус (лат. habitus - зовнішність, зовнішність), зовнішній вигляд тварини в момент дослідження. Визначається сукупністю зовнішніх ознак, що характеризують статура, вгодованість, положення тіла, темперамент і конституцію. Розрізняють статура (будова кістяка і ступінь розвитку мускулатури): сильне, середнє, слабке. Вгодованість може бути гарною, задовільною,
  9. К
      + + + Каверна (від лат. Caverna - печера, порожнина), порожнина, що утворюється в органах після видалення некротичної маси. К. виникають (наприклад, при туберкульозі) в легенях. К. можуть бути закритими і відкритими при повідомленні їх з природним каналом. Див також Некроз. + + + Кавіози (Khawioses), гельмінтози прісноводних риб, що викликаються цестодами роду Khawia сімейства Garyophyllaeidae,
  10. Н
      + + + Гній, цінне органічне добриво, що складається з екскрементів тварин, рідких відходів ферм і підстилкового матеріалу (солома, торф, тирса). Н. містить велику кількість мінеральних і органічних речовин, внесення яких в грунт підвищує її поживні властивості. Залежно від методу утримання тварин та системи збирання приміщення розрізняють Н. рідкий, напіврідкий і твердий. Рідкий
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...