загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові , генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Реплікація вірусу грипу

К. ШОЛТІССЕК і Х.-Д. Кленк (пор. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK)



I. ВСТУП

З проблеми реплікації вірусу грипу існує ряд оглядів. Література до 1968 р. узагальнена в статтях Hoyle (1968) 'і Scholtissek (1969); пізнішими роботами є огляди White (1973), а також Compans і Choppin (1974).

Більшість даних по реплікації отримано при 'вивченні вірусу грипу типу А. Істотних відмінностей у (механізм реплікації інших типів вірусу грипу поки не знайдено.

Набуло поширення кілька систем культур клітин, зручних для. вивчення реплікації, наприклад розмноження штаму WSN вірусу грипу в клітинах MDBK (Choppin, 1969) або розмноження вірусу чуми птахів (FPV) в клітинах фібробластів курячого ембріона. Приклад кривої зростання останнього вірусу в одиночному циклі доведений на 30, де латентний період дорівнює приблизно 3 год і продукція вірусу виходить на плато між 8 і 12 ч. Взагалі в таких системах клітин спостерігається високий вихід інфекційного вірусу, а синтез клітинних білків вельми ефективно пригнічується після інфекції. Тому такі системи дуже зручні для біохімічних 'досліджень.

II. АДСОРБЦІЯ, ПРОНИКНЕННЯ, «роздягання» ВІРУСУ

Зараження клітини вірусом починається з адсорбції, тобто прикріплення вірусної частки ж поверхні клітини. Для прикріплення необхідні дві комплементарні структури , а саме: рецепторні ділянки на 'поверхні клітини і вірусний компонент, відповідальний за впізнавання цих рецеп-раторних ділянок. Протягом багатьох років відома здатність вірусу грипу взаємодіяти з еритроцитами різного походження та агглютинировать їх (Hirst, 1941; McClelland, Hare, 1941) . гемаглютинацію була використана як модельна реакція взаємодії вірусу грипу з поверхнею клітини, і 'більшість ваших знань про це явище отримано з подібних досліджень. Проте слід бути дуже обережним в узагальненнях, оскільки структури-поверхні еритроцитів і поверхні інфіковані клітин можуть бути абсолютно різними (см . також гол. 3).

А. РОЛЬ гемаглютиніну У АДСОРБЦІЇ

Компонентом віріона, включающимся в зв'язування, є «шип» НА *. Роль вірусних-білків в ініціації інфекції була вивчена з використанням антитіл, специфічних до двох поверхневим білкам: НА * і NA *. Ці антитіла можуть бути отримані при використанні рекомбінантних вірусів. Наприклад, схрещування між вірусами АТ і А2 призводить до утворення рекомбінантов X7F1, який несе НА *, АТ і NA * A2 (Kilbourne et al., 1968). Антисироватка до вірусу X7F1 не пригнічує NA * вірусів грипу типу АТ, але інгібує гемаглютинацію і нейтралізує інфекційність вірусів цього типу. Взаємодія тієї ж сироватки з вірусами грипу типу А2 не пригнічує гемаглютинації або інфекційності , хоча нейтралізація активності NA * при цьому повна. Таким чином, NA * не включається в процес ініціації інфекції, і тільки НА *, до мабуть, відповідальний за адсорбцію. Ця концепція підтверджується даними про те, що вірусні частинки, з яких протеолітичними ферментами видалені одні лише нейрамінідазной «шипи», залишалися інфекційними (Schulze, 1970). Є дані, що гемагглютінірующімі частина локалізована на зовнішній частині «шипа» НА *, багатої вуглеводами (див. гл. 3). Вуглеводи, мабуть, необхідні для функціонування НА *, оскільки неглікозильовані білки НА * нездатні зв'язуватися з еритроцитами (Klenk et al., 1972b).

Б. РЕЦЕПТОР ВІРУСУ ГРИПУ

Вуглеводи є істотним (компонентом не тільки гемагглютішіна, а й вірусного рецептора на поверхні клітини. Hirst (1942) спостерігав, що | комплекс вірус - еритроцит нестабільний і що рецептор на поверхні «льотки руйнується ферментом вірусу. Як було показано пізніше, цим ферментом є нейрамінідаза, отщепляют нейрашшовую 'кислоту від глікопротеїнів (Klenk et al., 1955; Klenk, Stoffel, 1956; Gottschalk, 1957). Це було першою демонстрацією ферменту, що є складовою частиною вірусної частинки. Бактеріальні нейрамінідази також здатні руйнувати рецептори вірусу грипу (Burnet, Stone, 1947). Таким чином, було встановлено, що рецептор для вірусу грипу - це глікопротеїн, що містить нейряміно-ву кислоту.

З тих пір накопичено велику кількість інформації

про рецепторі миксовирусов, узагальненої недавно в огляді

Hughes (1973). Коротко отримані дані зводяться до сле

дме. Рецелторние ділянки містять залишки нейро-

іовой кислоти, які присутні у вуглеводних ланцюгах

глікопротеїнів. неокисляющих кінцеві залишки нейро-

нознла необхідні для взаємодії глікопротеїдів з ві

русом грипу . Обробка нейрамінідазою повністю знімає

зв'язує активність. Дослідження з деградації з ис

користуванням перйодати припускають, що для зв'язує

активності необхідна интактная молекула нейрамінової

кислоти (Suttajit, Winzler, 1971). Карбоксильная група,

ймовірно, також відіграє важливу роль, оскільки необхідні,

мабуть, і електростатичні сили (Huang, 1974).

Представляється ймовірним, що мається лише слабка спеці

фічность щодо структури, з якою зв'язується

нейрамінової кислота, оскільки, як було показано, цілий

набір глікопротеїнів, що містять яейраміновую кислоту,

зв'язується з міксовірусів. Більше того, гангліозиди ( гли-

коліпіди, містять нейрамінової кислоту) також явля

ються активними в цьому відношенні (Haywood, 1975).

Можна сподіватися , що питання зв'язування вірусу грипу проясниться в більшій мірі після встановлення молекулярної структури рецептора. До деякої міри це вже досягнуто в разі еритроцитів (Marchesi et al., 1973). Додаткову інформацію може також представити вивчення прикріплення міксовіруоов до штучних мембран (Tiffany, Blough, 1971).

В. МОЖЛИВІ МЕХАНІЗМИ ПРОНИКНЕННЯ І «роздягання»

Запропоновано два різних 'Механізму проникнення і «роздягання» не тільки вірусу грипу, а й взагалі вірусів, мають зовнішню оболонку. Обидві точки зору грунтуються головним чином. на дослідженнях в електронному мікроокопе. Один з таких механізмів - віронексіс, який,. як вважають, є процесом ппноцітоза, коли вірусні частки включаються до піносоми, зливаються згодом з лизосомами, і ферменти лізосом викликають «роздягання» вірусу (Fazekas de St. Grot, 1948). Електронно-мікроскопічні підтвердження цієї точки зору отримані в роботах Dales і Choppin (1962), а також Dourmashkin і Tyrrell (1970). Через 10 хв після зараження були видні вірусні частки, знаходяться в безпосередньому контакті з поверхнею клітини, а до 20-й хвилині частинки виявляли всередині цітоплазматічеокіх вакуолей. На противагу цьому дослідженню Morgan і Rose (1968) припускають, що проникнення може бути наслідком злиття оболонки вірусу з мембраною клітини-хазяїна. Таким чином, в даний час немає єдиної думки щодо механізму проникнення вірусу грипу.

Як описано в гл. 5, віріони вірусу грипу містять РНК-полімер'азу, асоційовану з їх рібонуклеопротеі-новими компонентами. Малоймовірно, отже, щоб процес «роздягання» був просторово роз'єднаний з процесом звільнення рібонуклеолротеіна. А ця стадія відбувається на поверхні клітини, згідно з механізмом злиття мембран, і в фагоцитарних везикулах, згідно з механізмом віройексіса.

III. ТРАНСКРИПЦІЯ А. ПОСЛІДОВНІСТЬ СИНТЕЗУ РНК

Після «роздягання» онРНК віріона повинна бути транскрибуватися в комплементарную РНК-Запроваджуване з інфікуючої часткою РНК-полімераза повинна функціонувати в першій стадії розмноження вірусу (див. гл. 5). Геном вірусу грипу може бути виділений з віріонів тільки у вигляді

окремих фрагментів (див. гл. 6). Більше того, він і функціонує у вигляді-окремих фрагментів, як 'було показано генетичним аналізом (ом. гл. 7) і ступінчастою інактивацією інфекційного вірусу (Scholtissek, Rott, 1964). У зв'язку з цим слід припустити,-що полімераза ініціює синтез РНК в кожному індивідуальному фрагменті. Оскільки РНК не існує в клітці у вигляді вільної молекули, а завжди одягнена білком, виникає питання: з яким білком пов'язана вірусна РНК в процесі своєї реплікації?

Досліди, проведені три вивченні синтезу РНК вірусу грипу, представляють великі труднощі, оскільки актино-мицин D не може бути використаний для виявлення продукції вірусної РНК при специфічному придушенні синтезу клітинних РНК, так як цей антибіотик пригнічує розмноження вірусу грипу (Barry et al., 1962; Rott, Scholtissek, 1964; Barry et al., 1965; Pons, 1967). З цієї причини для визначення послідовності синтезу РНК в часі застосували специфічну гібридизацію пульс-меченной РНК в різні моменти після зараження з надлишком або немічених вРНК, або вкРНК з наступною обробкою РНК-азой (Scholtissek, Rott, 1970). У ранніх стадіях інфекційного циклу превалював синтез вкРНК, досягаючи максимуму приблизно «про другого годині після зараження, тоді як у пізніх стадіях велика частина продукується вірус-специфічної РНК була вРНК. Krug (1972), використовуючи інший метод, також показав, що через 4 год після зараження синтез BIKPHK МАЙЖЕ ПОВНІСТЮ припиняється. Після екстракції фенолом виявляється відносно невелика кількість днРНК ( Scholtissek, Rott, 1970).

У зв'язку з тим що той чи інший тип вірусної РНК має інформаціонним1!! функціями і використовується як матриця для синтезу вірусних білків (див. розділ IVA), може мати місце деякий трансляційний контроль на рівні диференціального катаболізму вірусної РНК. Тому були проведені іульс-чейз-експерименти для вивчення стабільності РНК вірусу грипу in vivo. Встановлено, що на противагу клітинної РНК обидва типи вірусної РНК повністю стабільні протягом 90-шшутного періоду ченза (Scholtissek et al., 1972).

Раніше при дослідженні синтезу вірусної РНК in vivo, коли актиноміцин D додавали в пізніх стадіях інфекційного циклу (Duesberg, Robinson, 1967; Nayak, 1970; Ма-hy, 1970) , не враховували, що антибіотик специфічно Інги-бірует синтез комплементарної РНК in vivo (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Оскільки днРНК виділяється із заражених клітин у вигляді принаймні п'яти окремих фрагментів, був зроблений висновок, що вірусна РНК також синтезується у вигляді фрагментів (Pons, Hirst, 1968).

Б. ЛОКАЛІЗАЦІЯ синтез вірусної РНК всередині клітини-ГОСПОДАРЯ

З даних, отриманих при радиоавтографии, був зроблений висновок , що місцем синтезу вірусної РНК є, мабуть, ядра клітин (Scholtissek et al., 1962; Barry et al., 1974). Оскільки періоди пульсу, що застосовувалися в цих дослідженнях,-були все ще занадто великими, не можна виключити, що вірусна РНК синтезується в цитоплазмі клітини і після цього транспортується в ядра, де вона може накопичуватися. Крім того,, вРНК і вкРНК можуть синтезуватися в клітці в різних місцях.

В. інгібуванням синтезу вірусної РНК 1. Актімоміцін D, мітраміцін і а-аманитин

При додаванні актиноміцину D або мітраміціна, які перешкоджають матричної функції ДНК, до заражених клітинам в момент, коли там вже присутня вірусна РНК-залежна РНК-іолімераза (наприклад, через 2 год після інфекції), вРНК продовжує синтезуватися протягом ще приблизно 2 ч. Продукція вкРНК, однак, негайно припиняється. Пізніше синтез вРНК також падає, вказуючи на те, що для нього необхідно безперервна освіта вкРНК (Rott et al., 1965; Scholtissek, Rott, 1970; Scholtissek et al., 1970; Pons, 1973). Gregoriades (1970) показала, що актино-мицин D робить також сильний вплив на синтез вРНК при додаванні в пізніх стадіях інфекційного циклу. У цих дослідах синтез вірусної РНК визначали по збільшенню включення міченого уридину в тотальну РНК заражених клітин. Таке збільшення може бути усунуто додаванням актиноміцину D. Однак слід мати на увазі, що зараження вірусом грипу викликає збільшення включення міченого уридину в клітку після інфекції (Scholtissek et al., 1967) і що актиноміцин D надає інгібуючий вплив на це включення (Scholtissek et al., 1969). сіАмані-тин, який не має спорідненості до ДНК, & про впливає на активність однієї з клітинних РНК-полімерази (РНК-подімера-за II), також інгібує синтез вкРНК при додаванні в культуральну рідину відразу ж після зараження (Rott, Scholtissek, 1970; Mahy et al., 1972).

Механізм 'Специфічного інгібування цими антибіотиками синтезу вкРНК не зовсім зрозумілий, тому що вони не роблять впливу на освіту вкРНК in vitro. Таким чином, ці антибіотики діють тільки in vivo, хоча фермент, що синтезує вкРНК, може бути виділений з клітин, до яких через 2 год після інфекції був доданий актиноміцин D (Scholtissek, Rott, 1969a).

Розмноження 'вірусів грипу може' бути придушене також іншими впливами на ДНК клітини-господаря - введенням мітомнціна С, передобробці ультрафіолетовим опроміненням або видаленням ядер клітини перед інфекцією (Barry, 1964; Rott et al., 1965; Nayak, Rasmussen, 1966; Fol-.lett et al., 1974; Kelly et al., 1974). Механізм, за допомогою якого ці впливи впливають на розмноження. вірусу грипу, може 'бути однаковим з механізмом дії інших антибіотиків. Єдине припущення , 'яке можна зробити на підставі цих досліджень, це те, що є необхідність у' функціонально 'активних ядрах клітини і (або) в ДНК-залежної функції клітини для розмноження вірусів грипу. Що | це за функції-сказати не можна.

  2. Циклогексимид

  При додаванні циклогексаміду, специфічно переважної синтез білків у клітинах тварин, через 2 год після зараження вірусом грипу освіту вРНК негайно припиняється, тоді 1как освіту вжРНК все ще триває принаймні протягом 2 год (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Поки невідомо, чи необхідний безперервний синтез вірусного 'або' Клітинного 'білка, використовуваного в' Якості / кофактора для полімерази, що синтезує вРНК, або необхідний деякий 'білок (наприклад, NP-білок) для стабілізації знову синтезованої вРНК, або пригнічення синтезу певного вірусного 'білка призводить до безперервної освіти вкРНК, синтез якої в нормі вимикається через 3 год після зараження. Це вимикання може | бути необхідно для запуску синтезу вРНК-Дослідження з темпер атурочуветвітельнимі мутантами повинні відповісти на деякі з цих питань.

  Досліди Bean і Simpson (1973) показали, що первинна транскрипція in vivo (синтез вкРНК на матриці'РНК за допомогою полімерази інфікуючої частки) подавляется циклогексаміду, тоді ка, до актиноміцин D пригнічує транскрипцію повністю. Таким чином, циклогексимид не вплине in vivo на активність полімерази, що вводиться з інфікуючої часткою і синтезує вкРНК-Він, однак, пригнічує синтез нової полімерази, необхідної для виробництва вкРНК.

  3. Глюкозамін

  Глюкозамін, як відомо, виснажує пул УТФ в клітинах курячого ембріона шляхом утворення УТФ-] М-ацетілглкжо-заминаючи (Scholtissek, 1971). Коли розчин Ерла, що містить глюкозу, використовується як жультуральной середовища, він

  впливає тільки на синтез вірусних глнкопротеі-нів (див. розділ V). Якщо, проте, глюкозу як джерело енергії замінити ліруватом або фукоза, то виснаження пулу УТФ цими аміноцукром відбувається приблизно в 10 разів активніше. За цих умов пул УТФ клітини-господаря стає специфічним обмежувачем акорі синтезу вРНК, тоді як синтез (клітинної РНК ще не зачіпається (Scholtissek, 1975). В результаті придушення синтезу вірусної РНК відсутній і освіта вірусних білків.

  Ці дані можуть бути інтерпретовані двояко: або вірусна РНК-залежна РНК-полімераза має низьку спорідненість до УТФ в порівнянні з клітинними ДНК-завісімим'і РІК-полімеразами, або в клітці існують два більш-менш незалежних пулу УТФ, один з яких може ' бути використаний для синтезу вірусної РНК і відчуває більший вплив з боку глюкозаміну, ніж інший пул, який може використовуватися як субстрат РНК-по-лімеразамі «льотки.

  Г. синтез вірусної РНК IN VITRO

  У клітинах, заражених вірусом грипу, кількома дослідниками виявлена ??РНК-залежна РНК-полімераза (Але, Walters, 1966; Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970; Compans, Cali-guiri, 1973). Велика частина активності ферменту виявлена ??в мікросомальної фракції заражених клітин. В системі in vitro ця активність знімається РНК-азой, але не ДНК-азой. Це означає, що внутрішній матрицею є РНК-Реакція вимагає присутності всіх чотирьох нуклеозидтрифосфатів і чутлива до актином-іціну D. Велика частина продукції реакції in vitro має низьку відносну молекулярну масу. Дані Horisberger і Guskey (1973) припускають, що в цитоплазмі присутні дві різні активності ферментд: одна є М § + +-завіеімой і пригнічується відносно високими концентраціями солей, інша - Мп + +-залежна і більше резистентна до солей. Остання активність ферменту виявляється також всередині вірусної частки (див. гл. 5).

  Щодо продукту цітоллазматіческого ферменту в системі in vitro отримані суперечливі результати. Ruck | і співавт. (1969) повідомили, що в їх руках цей фермент синтезує принаймні 'деякі з РНК віріони типу (від 14 до 19S). Автори прийшли; до такого висновку при визначенні складу підстав продукту в системі in vitro після інкубації мікросомальної фракції з усіма чотирма [3Н]-міченими нуклеозидтрифосфат відомої питомої радіоактивності. Проте дані з вивчення найближчих

  до адениловой кислоті сусідів, лолученние в тій же роботі з використанням, [(а-32Р] АТФ, узгоджуються з даними аналізу найближчих сусідів,. отриманими Scholtissek (1969), в результаті чого був зроблений висновок про те, що продукт в системі in vitro має структурою вкРНК. Mahy і Bromley (1970) у своїй первісній публікації також заявили, що деяка частина продукту в системі in vitro, отриманого за допомогою цитоплазматического ферменту, повинна 'бути вРНК. Проте нещодавно Hastie і Mahy (1973) при аналізі найближчих сусідів і специфічної гібридизації підтвердили освіту цитоплазматическим ферментом майже виключно вкРНК, як це було вперше показано Scholtissek (1969). Caliguiri і Compans (1973) також виділяли РНК-по-лімеразу з цитоплазми клітин, заражених вірусом грипу, яка в системі in vitro синтезувала РНК, що не менше 90% якої має послідовність підстав, комплементарную чвРНК. Hastie і Mahy (1973) «Ашлі, що значний відсоток продукту в системі in vitro, синтезованого ядерним ферментом у присутності актиноміцину D, що не-був здатний пібрідізоватьея з немічених вРНК-Поки неясно, якого типу РНК не здатна до такої гібридизація. Дуже мала частина РНК, що синтезується за цих умов, Гібро-дізуется з немічених акРНК (Scholtissek, неопубліковані дані).

  Кінетика включення міченого ГТФ у вірусну РНК може бути інтерпретована як свідчить про те, що реініціація синтезу РНК в системі in vitro відсутня. Якщо неочищений препарат ферменту інкубують при низьких концентраціях солей, майже вся знову синтезована РНК спочатку є однонитчатим. Однак після екстракції фенолом 'великий відсоток РНК стає РНК-азорезістентним. Фенол переводить проміжну репліка-тивную структуру,, що складається з однонитчатим матриці і знову синтезованої вкРНК, утримуваних один з одним в місці реплікації молекулою 'полімерази, в частково дво-нитчатую структуру (Feix et al.
трусы женские хлопок
 , 1967; Oberg, Philipson, 1971). Ці дані про продукт ферменту вірусу грипу в системі in vitro можна інтерпретувати таким чином, що полімераза не тільки ініціює і продовжує полімеризацію, але вона відокремлює знову синтезовану ланцюг від своєї матриці. В іншому випадку утворюється двунитчатая структура РНК, яка не володіє 'біологічними функціями (Paffenholz, Scholtissek, 1973). Якщо інкубація проводиться при високій концентрації солей або з очищеним ферментом, великий відсоток продукту вже є двунитчатой ??РНК до екстракції фенолом (Schwartz, Scholtissek, 1973).

  Ця властивість РНК-нолімерази вірусу грипу синтезувати виключно вкРНК в системі in vitro-було викорис-

  . Зовано для встановлення генетичної спорідненості різних штамів вірусу грипу з визначення гомології в послідовності підстав між ними (Scholtissek, Rott, 1969b; Hobson, Scholtissek, 1970; Anschutz et al., 1972).

  IV. СИНТЕЗ вірусних білків

  А. ТРАНСЛЯЦІЯ В СИСТЕМІ IN VITRO

  Проблема РНК якого типу-вир іонного або комплементарного - є 'інформаційної для синтезу вірусних білків, поки не вирішена. Були отримані суперечливі результати щодо виду віруеспеціфіческой РНК, пов'язаної з полісоми. Nayak (1970) виявив в полі-сомной області сахарозного градієнта, головним чином вРНК, в той час як Pons (1972) виділив з полісами виключно вкРНК. Останнє було підтверджено спостереженням, що після додавання через 2 год після зараження актиноміцину D, який переважно впливає на синтез вкРНК (див. розділ III, В, 1), в полісомах заражених клітин вкРНК не виявляється (Pons, 1973).

  Використовуючи 'белоксінтезірующую систему з Е. coli і вРНК вірусу грипу як матрицю, Siegert і співавт. (1973) виявили утворення вірусного NP-білка в умовах in vitro. Цей мічений NP-білок-був охарактеризований методом преципітації в гелі по тесту Ouchterlony. На противагу цьому Kingsbury: і Webster (1973) не спостерігали ніякого вірусного білкового синтезу з вРНК, використавши бе-локсінтезірующую систему, отриману з ретикулоцитів кролика. У цій же системі, однак, вони виявили синтез вірусного М-білка (ом. гл. 2) на матриці РНК, ізольованої з заражених клітин. Таким чином, на даний момент не можна відповісти на запитання, чи тільки віріопная або тільки комплементарная, або деякі фрагменти РНК одного типу і деякі фрагменти РНК іншого типу використовуються як матриці для синтезу білків. Отже, поки до вірусів грипу важко застосовувати визначення «негативна» або «позитивна» вірусна ланцюг, як це запропоновано Baltimore (1971).

  Б. СИНТЕЗ вірусних білків IN VIVO

  Вивченню синтезу вірусних 'білків' сприяє те, що в зараженій клітині синтез поліпептидів клітини заміщається вірусспеціфіческой синтезом. У клітинах фібробла-стів Курячого ембріона, заражених ВЧП (Joss et al., 1969; Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973), і в клітинах BHK 2IF заражених | штамом WSN вірусу грипу (Lasarowitz et al., 1971), до 4-ту годину після інфекції синтезуються майже

  тільки одні вірусні білки (31). Дещо раніше дослідники в заражених кльошах спостерігали синтез трьох або чотирьох поліпептидів (Taylor et al., 1969; Joss et al.,. 1969; Holland, Kiehn, 1970; White et al., 1970). Згодом були виявлені й інші поліпептиди (Lazorowitz et al.,. 1971; Skehel, 1972; Klenk et al., 1972b; Krug, Etkind, 1973). Загалом у заражених клітинах були виявлені всі структурні-білки: один або два Р-білка, субодиниця нуклеокап-Оіда NP, мембранний білок М, гемагтлютініяовий Глік-протеїн в нерасщепленной (НА) і розщепленої (НА1 і НА2) формах і субодиниця NA.

  Крім віріони 'білків, були описані один або два неструктурних білка (NS).

  Є помітні відмінності <в рівнях синтезу окремих вірусних поліпептидів. NP-і NS-поліпептиди зазвичай першими виявляються в заражених «льотках. Skehel (1973) припустив, що поліпептиди Р2, NP і NS, які першими виявляються в «клітинах, заражених ВЧП, є

  продуктами фрагментів РНК, утворених при селективної транскрипції вирионной полимеразой трьох фрагментів вірусного генома. Коли «льотки заражали у присутності цик-.логексіміда і пульсову мітку додавали після видалення антибіотика, виявлялися тільки три ці поліпептиду. На підставі цього припустили, що молекули РНК для цих. Компонентів утворилися за допомогою введеної вирионной лолімерази в процесі первинної транскрипції. З 4-го по 6-й годину після зараження курячих фібробластів ВЧП збільшується рівень синтезу М-білка, а синтез NS-лолілепті-так зменшується (Skehel, 1972, 1973). Таким чином, рівні синтезу іоліпептідов можуть індивідуально контролюватися і можуть варіювати протягом циклу зростання.

  Крім розщеплення. Поліпептиду НА на НА1 і НА2, немає даних про те, що вірусспеціфіческой поліпептиди вірусу грипу виходять в результаті розщеплення великих попередників (Taylor et al., 1969; Lazarowitz et al., 1971, Skehel, 1972; Klenk, Rott, 1973 ).

  Нещодавно була отримана нова інформація про локалізацію вірусних компонентів в заражених клітинах при використанні авторадіографії (Becht, 1971) або методів фракціонування клітини та електрофорезу в гелі (Taylor et al., 1969, 1970). Згідно з цими дослідженнями, синтези всіх вірусних | білків здійснюються, мабуть, в цитоплазмі. Попередні дослідження локалізації нуклеолротеінового антигену методом імунофлюоресценції інтерпретували як вказують на те, що синтез здійснюється в ядрі з подальшим виходом антигену в цитоплазму (Liu, 1955; Brei-tenfeld, Schafer, 1957; Holtermann et al., 1960). Однак ясно, що імунофлюоресценція визначає накопичення антигену,. А не його синтез (див. розділ IV, Б, 2).

  1. РНК-полімераза

  Вірус-специфічна активність РНК-залежної РНК-по-лімерази може бути виявлена ??в клітинах, заражених вірусом грипу, між 13Д і 3 год після інфекції в залежності від використаної системи клітин (Scholtissek, Rott, 1969а; Skehel, Burke, 1969; Ruck et al., 1969; Mahy, Bromley, 1970). Це перша виявляється вірусспеціфічеокая активність після зараження. Велика частина вірусної активності лолімерази виявляється в мікросомальної фракції; деяка ж частина цієї активності залишається в ядрах і не може | бути видалена звідти навіть інтенсивним їх промиванням. Фундаментальні відмінності в кінетиці прояви або в необхідних кофакторів між ядерним і мікросомальним ферментами відсутні (Scholtissek, Rott, 1969a; Mahy et al., 1975).

  При подальшому фракціонуванні цитоплазми в ступінчастому сахарозний градієнті то методом Caliguiri і Tamm (1970) активність полімерази виявляється в шорстких мембранах (Compans, Caliguiri, 1973; Klenk et al., 1974a).

  Оскільки активність вірусної полімерази була виявлена ??в очищених вірусних частинках (див. гл. 5), виникає питання, з яким із вірусних 'білків вона може бути асоційована. Полімераза, 'виділена з клітин, заражених вірусом грипу, була очищена приблизно в 200 разів. Єдиним вірусспеціфіческой продуктом, асоційованим з активністю полімерази, був РНП-антиген (білок NP плюс вірусна вРНК, певні то методом зв'язування комплементу). Всі спроби видалити РНК з цього комплексу приводили до повної втрати активності ферменту (Schwarz, Scholtissek, 1973). Кандидатом на роль вірусної полімерази був висунутий Р-білок (Kilbourne et al., 1972). Коли ферментативний 'комплекс, мічений in vivo амінокислотами, виділяли з клітин, заражених вірусом грипу,, і очищали приблизно в 35 разів, електрофоретичний аналіз виявив спочатку в цьому комплексі тільки ир-біло <(Compans, Caliguiri, 1973). Згодом, однак, за інших умов введення; мітки вдалося виявити і Р-білок (Caliguiri, Compans, 1974). З іншого боку, Klenk і співавт. (1974) виявили Р-білок в цитоплазматичної золі, 'який не володіє полімеразної активністю (Scholtissek, Rott, 1969a; Skehel, Burke, 1969). Ці спостереження можуть означати, що Р-білок здійснює свою (Передбачувану активність ферментів тільки при зв'язуванні з РНП-антигеном.

  Те, що сам по собі РНП-антиген володіє полімеразної активністю, малоймовірно, оскільки гіперімунна сироватка проти РНП-антигену НЕ інгібнрует активності полімерази, тоді як конвалесцентная сироватка, яка може містити антитіла до полімер азе, інгібує її (Scholtissek et al., 1971) . Така конвалесцентная сироватка (яка була отримана з тварин, які перенесли інфекцію вірусам грипу А) інгі'біровала активність полімерази всіх вивчених штамів вірусу грипу А, але не пригнічувала активність полімерази вірусу грипу В. Всі ці спостереження узгоджуються, з ідеєю про те, що РНП- антиген (BPHK + NP==білок), може служити матрицею для синтезу вкРНК-

  2. Білок нуклеокапсида

  NP-білок зв'язується з 'вірусної РНК, утворюючи РНП-антиген. Це вірно для NP-білка, виділеного не лише з віріона, но.і із зараженої клітини (Schafer, 1957). 'Серологічними засобами він може бути вперше виявлений, при-

  мірно через 3 год після зараження, за годину до появи гемаг-глютініна (Breitenfeld, Schafer, 1957). По закінченні цього часу титр РНП-антигену істотно не збільшується. Це може відбуватися внаслідок рівноваги між новим синтезом і включенням в зрілі частинки. За мітці NP-білок може 'бути виявлений в заражених клітинах протягом 2-ї години після інфекції (Scholtissek, Rott, 1961; Krug, 1972).

  За допомогою флуоресцентних антитіл РНП-антиген спочатку виявляється в ядрах. Пізніше він з'являється і в цитоплазмі (Breitenfeld, Schafer, 1957). За певних умов, таких, як абортивна інфекція (Franklin, Brieten-feld, 1959), у присутності р-флюорофенілаланіна (Zimmer-mann, Schafer, 1960), або в умовах феномена фон-Магнуса (Rott, Scholtissek, 1963), РНП -антиген залишається в ядрах.

  Раннє накопичення РНП-антигену в ядрах заражених клітин не означає, що NP-білок також синтезується всередині ядер. Авторадіографіческімі дослідження, а також застосування методів фракціонування клітини вказують на ц'ітоплазматіческій синтез цього та іншого, багатого аргініном, білка і на швидкий транспорт їх з цитоплазми в ядра (Taylor et al., 1969, 1970; Becht, 1971).

  У екстрактах заражених клітин певна фракція РНП-антигену містить вкРНК (Pons, 1971; Krug, 1972; Krug, Etkind, 1973), хоча у вірусних частинках знаходять тільки один тип РНК (що випливає з відсутності будь-якої самогібрідізаціі вРНК) (Scholtissek, Rott, 1971; Pons, 1971). Неможливо вирішити, чи має РНП-антиген, що містить вкРНК, специфічне значення в процесі розмноження вірусів або він є лише артефактом, які з'являтимуться в процесі клітинного фракціонування. Було показано, що обидві ланцюга РНК однаково добре зв'язуються з NP-білком in vitro (Scholtissek, Becht, 1971). Таким чином, якщо є скільки-небудь вільного NP-білка і вільної вкРНК, в процесі гомогенізації негайно утворюється відповідний РНП-антиген. Віріонна РНК. Може бути витіснена з РНП-антигену полівін'ІлсульфатО'М (Pons et al., 1969). Отже, можна перевірити, здійсненно чи заміщення різних вірусних РНК в РНП-антигене в клітинних гомагенатах. Із змін складу підстав вірусної РНК, меченной протягом різних проміжків часу 32Р і виділеної з цитоплазматического РНП-антигену, Krug (1972) укладає, що деяка частина вкРНК, перш ніж вона включиться в РНП-антиген, існує у вигляді, вільному від NP- білка. Включення 32Р в РНК жлеток тварин відбувається зі значною лаг-фазою через досить повільного включення міченого, фосфору 'в' (х-положення нуклео-зідтріфосфатов (Scholtissek, 1965). До тих пір, поки відповідні коригування для розрахунків змін складу

  підстав не зроблені, дані Krug (1972) слід інтерпретувати з обережністю.

  Кінетичний аналіз «появи РНП-антигену в ядрах і цитоплазмі, проведений Krug (1972),-припускає, що РНП-антиген, що накопичується в ядрах, не є попередником РНП-антигену, знайденого в цитоплазмі.

  3. Неструктурні білки

  Для заражених клітин було описано декілька неструктурних вірус-специфічних білків-невідомої функції. Один з них з відносною молекулярною масою 25 000, що накопичується в 'великих кількостях, був позначений як NS (Lazarowitz et al., 1971). У поліакриламідних гелях він має швидкість міграції, близьку до рухливості М-бел-ка. Однак обидва білка, мабуть, не залежать одне від одного, як видно з відмінностей в їх пептидних картах. Великі 'кількості NS-' білка виявлені в ядрах (Lazarowitz et al.,. 1971; Krug, Etkind, 1973). Ці відомості узгоджуються з даними попередніх імунофлюоресцентних досліджень Dim-mock (1969), який спостерігав 'яскраве фарбування ядер з антісиворопкой, специфічної ж неструктурних вірусних антигенів, і це фарбування, ймовірно, відображало наявність NS-' білка. Як 'було встановлено, цей білок також є основним вірус-специфічних білків у фракціях вільних і пов'язаних з мембранами рибосом, що виділяються із заражених клітин (Pons, 1972; Compans, 1973; Klenk et al.,. 1974a). Асоціація NS зрибосомами, мабуть, залежить від тонною сили (Krug, Etkind, 1973). У буферах з низькою іонною силою ЦЕЙ ноліпаптід-адсорбувався на обох ри-босомальних субодиниць, тоді як при додаванні солі віддалявся від них.

  Недавнє дослідження (Gregoriades, 1973) висунуло деякі сумніви в ідентифікації NS як неструктурного 'поліпептиду, відмінного від віріони поліпептиду М. Виявилося можливим екстрагувати М-поліп-ептід з віріони © кислим хлороформметанолом, і білок з ідентичною електрофор етвческой рухливістю може-бути також екстрагований з цілих заражених клітин,-ядер або полісом. Аналіз-продуктів тріптіческоі обробки М-'білка, а також ядерного і асоційованого з рибосомами-білків, привів до безлічі збігів, що припускають, що М-і NS-білкою' ідентичні. Необхідна, однак, подальша інформація для переконливого пояснення цих результатів.

  На додаток до NS можуть існувати інші неструктурні вірусспеціфіческой комлоненти, хоча жоден з них. не був достатньо охарактеризований. Використовуючи антисироватки, спрямовану проти неструктурних вірусних антигенів,

  Dimmock і Watson (1969) преципітувати радіоактивно мічені поліпептиди із заражених клітин. Електрофор-тичний аналіз в поліакриламідному гелі дозволив припустити наявність декількох неструктурних поліпептидів з основним компонентом, відповідним NS. Один з залишаються неструктурних компонентів мігрує більш швидко і може відповідати компоненту з відносною молекулярною масою від 10 000 до 15 000, описаному Skehel (1972), Krug і Etkind (1973).

  4. Мембранний М-білок

  М-білок, який 'вистилає внутрішню поверхню подвійного ліпідного шару оболонки і яким багатий вирион, знаходять в заражених клітинах у відносно невеликих кількостях. Це передбачає не тільки контрольованість синтезу М-белма, а й можливість того, що цей синтез є лімітуючої стадією репродукції вірусу (Lazarowitz et al., 1971). Цю концепцію підтримують дані про те, що при температурі 29 ° С, при якій освіта вірусу придушене, М-білок є єдиним (вірусопе-діфіческім білком, який не можна виявити в заражених клетмах (Klenk, Rott, 1973).

  М-білок {можна виявити на гладких і плазматичних мембранах заражених клітин (Lazarowitz et al., 1971; Corn-pans, 1973a; Klenk et al., 1974a). Ці дані свідчать про спорідненість цього білка до мембран.

  5. Гемаглютинін

  Гемаглютинін синтезується як великий глікопроте-ін - попередник НА, який згодом розщеплюється на два менших глікопротеїну: HAi і НА2 '(Lazarowitz «t al., 1971). Розщеплення, яке можна придушити інгібіторами протеаз (Klenk, Rott, 1973), здійснюється, мабуть, протеолітичними ферментами клітини-хазяїна (Lazarowitz et al., 1973). Ступінь розщеплення залежить від штаму вірусу, клітини-господаря, рівня цітоіатіческого ефекту і присутності або відсутності в середовищі сироватки (Lazarowitz et al., 1971, 1973а, b; Klenk, Rott, 1973; Stanley et al., 1973). Так, ВЧП, вирощений в культурі фібробластів курячого ембріона, містить тільки розщеплені глішпротеіни ге-магглютнніна, тоді як таке розщеплення фактично відсутня, якщо вирощувати віріони WSN в клітинах MDBK в відсутність сироватки. У присутності сироватки, однак, гемаглютинін WSN також розщеплюється. Розщеплення в цій

  системі має місце на. плазматичної мембрані (Lazaro-witz et al., 1973a). В системі ВЧПмеханізм такого розщеплення, мабуть, інший. Розщеплення «відбувається. На внутрішньоклітинних мембранах, і плазміноген в цьому випадку не є необхідним (друзки et al., 1974a). Ступінь розщеплення різко зменшується три 25 ° С (Klenk, Rott, 1973).

  Розщеплення НА не є необхідною умовою для гемагглютінірующей активності і для складання віріона (La-zarowitz et al., 1973a; Stanley et al., 1973), але дослідження,, проведені нещодавно, 'виявили, що воно необхідне для інфекційності (Klenk et al ., 1975b). Ці дані узгоджуються з гіпотезою про те, що, крім своєї ролі в адсорбції, НА * має й іншу функцію в інфекційному процесі та що розщеплення необхідно для цієї функції. На підставі того, що розщеплення НА є феноменом, залежних від «льотки-господаря, і що частинки, що містять нерасщеплен-ний НА, мають низьку інфакціонностью, припускають залежність діапазону господарів і поширення інфекції вірусу грипу від присутності протеази клітини-господаря як. активирующего ферменту.

  У дослідах з фракціонування «вічко, заражених ві

  русом грипу, виявлено,, що глікопротеїни НА завжди ас

  соцііровани з мембранами (Compans, 1973a; Klenk et al.,.

  1974а). Внутрішньоклітинна локалізація цих білків ж їх мить

  рація від шорстких мембран до гладких ендоллазматіче-

  ського ретикулума і до плазматичноїмембраною будуть де

  тально описані в розділі VII, В.. .,

  6. Нейрамінідазу

  Вірусна NA * як активний фермент була виявлена,

  через 3 год після інфекції в хоріон-аллантоіених мембра

  нах, і шляхом екстраполяції встановлено, що початок її сін

  теза доводиться на 1-2-е години після зараження (Noll et al.,

  1961). Внутрішньоклітинну локалізацію NA * досліджували пу

  тим фракціонування клітин, і знайшли, що вона, по-мабуть

  му, подібна локалізації НА * (Compans, 1973a; Klenk et al.,,

  1974а). NA * була виявлена ??в асоціації з мембранами,

  отриманими з гладкого ендоплазматічеекого ретикулума,

  при визначенні її з біологічної активності і по анали

  зу в полйажріламідном гелі. Активність ферменту була най

  дена також у фракціях, що містять шорсткі мембра

  ни. Ці дані узгоджуються з даними, отриманими при

  іммунофлюорееценціі (Maeno, Kilbourne, 1970). Через 4 год

  після зараження яейрамінідазу можна виявити в цито

  плазмі; пізніше вона, мабуть, концентрується на пери

  Ферія клітини.

  V. СИНТЕЗ ВУГЛЕВОДІВ

  Вуглеводи беруть участь в утворенні глікопротеїнів і гли-колілідов оболонки вірусу грипу (Klenk et al., 1972a). Гли-коліпіди миксовирусов (відбуваються з плазматичних мембран клітини-хазяїна (Klenk, Choppin, 1970), «про не було визначено, що переважно (включається в вирион: вже існували чи знову синтезовані гліколіпіди.

  Використання радіоактивних попередників, таких, як глюкозамін, манноза, галактоза і фукоза, які специфічно включаються в вірусні глмкопелтіди, показало, що вуглеводні бічні ланцюги цих глікопептидів знову синтезуються в процесі інфекції (Haslam et al.
 , 1970; Corn-pans et al., 1970a; Schwarz, Klenk, 1974). Досліди з фракціонування (клітин дали додаткову інформацію про місця глікозилювання вірусних глікопротеінав. Глюкозамін асоційований з НА-полипептидом у фракціях як гладких, так і шорстких цітоплаематіческіх мембран; однак фукоза асоційована з НА в гладких, але не в шорстких мембранах (Compans, 1973b). . Придушення білкового синтезу пуромицина майже негайно зупиняє включення глюкозаміну, в той час як фукоза ще продовжує включатися протягом приблизно 10-15 хв (Stanley et al., 1973). Нарешті у FPV гликопротеид - попередник НА та продукти розщеплення HAj <і НА2 містять , мабуть, повний склад манози «глюкозаміну, тоді як вміст фукози і галактози значно вище в продуктах розщеплення (Klenk et al., 1975a; Schwarz, Klenk, 1974). Ця спостереження припускають, що біосинтез вуглеводних бічних цілей глікопротеїнів НА здійснюється за стадіями з різними залишками Сахаров, що додаються в різних ділянках клітини. Глюкозамін та манноза (приєднуються, мабуть, до поліпептидів НА на шорстких мембранах незабаром після або навіть у процесі синтезу поляпептіда, в той час як фукоза, ймовірно, прикріплюється пізніше за допомогою трансфераз , присутніх у гладких мембранах.

  Ці глікозілтрансферази є, ймовірно, ферментами клітини. Отже, вуглеводна (частина глікопротеїдів визначається, мабуть, клежой-господарем. Є, однак, свідчення того, що на додаток до цих ферментам клітини-хазяїна істотну роль в утворенні вуглеводних бічних ланцюгів грає вірусна NA *. Встановлено, що поверхня оболонок мікеовірусов позбавлена ??нейрамінової кислоти (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970), в той час як у вірусних оболонках, які не містять цього ферменту, такий вуглевод є звичайною складовою частиною (Klenk, Choppin, 1971; McSharry, Wagner, 1971 ; Renkonen et al., 1971). Ці дані дозволяють припустити, що отеут-

  ствие нейрамінової кислоти є суттєвою особливістю миксовирусов. Нещодавно вдалося показати, що NA * відповідальна за видалення нейрамінової кислоти з оболонки вірусу грипу, запобігаючи тим самим утворення на вірусної оболонці (рецепторів, які в іншому випадку приводили ои до утворення великих агрегатів вірусних частинок (Palese et al., 1974). Ці дані підтримують концепцію, що вуглеводна частина НА * як основного поверхневого глікопротеїну є продуктом - комбінованої дії (Клітинних транефераз та вірусної NA *. Завдяки її дії вірус здатний вводити вірус-специфічну модифікацію в (Спочатку специфічну для господаря, складну структуру вуглеводу-модифікацію, яка, мабуть, істотна для-біологічної активності вірусу.

  D-глюкозамін і 2-дезокси-0-ГЛК> коза інгібують утворення біологічно активного НА *, NA * та інфекційного вірусу (Kilbourne, 1959; Kaluza et al., 1972). Біохімічні дослідження виявили, що ці цукру. Конкурують з біосинтезом вірусних глікоггротеінов (Ghandi et al., 1972; Klenk et al., 1972b). У присутності цих інгібіторів розмір глігко-пр'отеідов НА зменшується. Ступінь зменшення залежить від дози. Так, при збільшенні концентр! Ации цукру глікопроте-пд НА з відносною молекулярною масою 76 000 поступово перетворюється в з'єднання з молекулярною масою 64 000, яке було позначено як HA0 (Klenk et al., 1972b; Schwarz, Klenk, 1974). Зрушення молекулярної маси паралельний зменшенню вмісту вуглеводів і, як-було встановлено, білок HA0 майже вільний від вуглеводів (Schwarz, Klenk, 1974). Ці результати показують, що HA0 є не повністю глікозильованого або «еглікозілірованной поліпептидного ланцюгом глікопротеїну НА і що« нгібірующее дію D - глюкоз амін а і 2-дезокси-0-глюкози здійснюється завдяки пошкодження глікозильованого-ия. Поліпептид HA0 асоційований-з мембранами, як-і нормальний НА. Він також мігрує від шорсткого до гладкому еядопла-з-| матічеокому ретикулуму, де розщеплюється на поліпептиди НА01 і НА02. Отже, вуглеводи,-ймовірно, несуттєві для спорідненості цього поліпептиду до мембрани. Однак відсутність гемагглютінірующей активності в заражених клітинах припускає, що неглікоз-ілірованний білок не здатний зв'язуватися з рецепторами.

  VI. СИНТЕЗ ЛІПІДІВ

  Як і всі віруси, що володіють оболонкою, вірус грипу набуває свої ліпіди шляхом утилізації ліпідів клітини-хазяїна. Це положення підтверджується наступними спостеріга-

  новами. Ліпідний склад вірусу грипу, як було встановлено,-аналогічний такому клітини-хазяїна (Ambruster, Beiss, 1958; Frommhagen et al., 1959). Ліпіди клітини-господаря, радіоактивно мічені-перед зараженням, включаються до вірусні частки (Wecker, 1957). При вирощуванні вірусу в різних клітинах-господарях виявляються модифікації вірусних ліпідів (Kates et al., 1961, 1962). Взагалі ліпіди вірусів, (які | відбруньковуються від клітинної поверхні, близько отр! Ажают ліпідний склад плазматичної мембрани клітини-хазяїна (Klenk, Choppin, 1969; 1970а, b; Renko-nen et al., 1971). Рівень синтезу de novo ф- осфолілідов в клітинах фібро-бластів курячого ембріона залишався незмінним протягом 7 год після зараження вірусом грипу; після цього весь синтез ліпідів був пригнічений (Blough et al., 1973). Це придушення, ймовірно, не є первинним ефектом, а може бути вторинним по відношенню до Інги-Біро-ванию синтезу РНК або білка або до '. іншим цнтолетіческім ефектів.

  Таким чином, на підставі результатів, отриманих до теперішнього часу, можна припустити, що синтез вірусних ліпідів здійснюється за допомогою нормальних клітинних процесів біосинтезу ліпідів, а вірусна оболонка формується шляхом включення ліпідів з плазматичної мембрани клітини-хазяїна.

  VII. ЗБІРКА (див. також гол. 2)

  А. ОСВІТА Нуклеокапсид

  Як вже говорилося, найбільш ймовірно, що білок нук-леокапсіда синтезується в цитоплазмі. Мабуть, він присутній там протягом короткого часу у вільній формі, а потім асоціює з вірусної РНК, утворюючи нук-леокапсіди (Klenk et al., 1974; Compans, Caliguiri, 1973). Оскільки NP-білок-швидко включається в яуклеокапсіди, РНК може відбиратися з ^ реформованого пулу (Krug, 1972). Внаслідок малих розмірів нуклеокапсидов вірусу грипу вони не можуть бути точно ідентифіковані в заражених клітинах за допомогою електронної мікроскопії. Скупчення ниток або волокон діаметром близько 5 нм, що спостерігаються в цитоплазмі, можливо, представляють вірусні рибо-нуклеопротеїни (Apostolov et al., 1970; Compans et al., 1970b).

  Наявні дані вказують на те, що РНК-геном віріонів вірусу грипу складається з 5-7 фрагментів (див. гл. 6).

  Отже, будь інфекційна частка потребує хоча б в одній копії кожного фрагмента. Hirst (1962) перед-

  поклав, що нуклеокапсиди з внутрішньоклітинного пулу можуть включатися до (віріони випадково. Частка 'інфекційних вирио-нов Е популяції може бути збільшена шляхом включення додаткових фрагментів РНК в середній вірний (Compans et al., 1970). Наприклад, якщо для інфекційне ™ необхідні п'ять різних фрагментів РНК, під кожен Вірна містить в цілому 7 фрагментів, включених в Вірний случай.ю, то приблизно 22% вир-іонів повинні бути інфекційними. Свідчення на користь випадкового включення фрагментів РНК були підкріплені недавніми спостереженнями Hirst (1973) про те, що в вірусної популяції здійснюється рекомбінація між частинками, що не утворять бляшок. Здатність таких частинок брати участь у рекомбінації можна пояснити відсутністю одного або більше фрагментів в частинках при варіюванні відсутніх фрагментів від однієї частинки до іншої; таким чином, відповідні нари дефектного вірусу можуть утворювати рекомбінанти.

  Б. ПРОЦЕС отпочковиванія ВІРУСУ

  Як і більшість вірусів, що мають оболонку, вірус грипу збирається на преформованих мембранах клітин; складання здійснюється шляхом отпочковиванія від плазматичної мембрани. Перша демонстрація звільнення вірусу від «льотки за допомогою процесу, не включає лізис, 'була представлена ??Murphy і Bang (1952) в ранніх електронно-мікроскопічних дослідженнях клітин, зар; Ажен вірусом грипу. Були видно виступаючі від 'поверхні клітини в позаклітинний простір ниткоподібні і | кулясті структури. Вірусних частинок усередині клітин під час утворення 'інфекційного вірусу не було видно і. з цього, отже, випливало, що вірусні частинки формувалися на поверхні клітини. Використовуючи мічені феритину антитіла, Morgan і зі авт. (1961) спостерігали, що поверхня (клітини містить вірусний антиген в тих областях, де формується вірус. Пізніші електронно-мікроскопічні исследов; ания показали, що поверхня відбруньковуватися вірусу містить таку ж, як і клітина-господар, мембрану з шаром виступів, відповідних вірусним «шипам» на зовнішній поверхні. На внутрішній поверхні вірусної мембрани мається відсутній на поверхні клітини додатковий електронно-щільний шар, який, ймовірно, складається з М-іоліпептідов (Bachi et al., 1969; Compans, Dimmock, 1969; Apostolov et al ., 1970).

  Дослідження в електронному мікроскопі дали підстави | припустити порядок, в якому вірусні компоненти ас-

  соцііруют на мембрані клітини (Bachi et al., 1961; Compans, Dimmock, 1969; Compans et al., 1970b).

  Першими з'являються білки вірусної оболонки, включаючись в деякі області мембрани, які повинні мати нормальну морфологію; однако. Спостережувана специфічна адсорбція еритроцитів на цих областях мембрани вказує на присутність тут. НА-білка. Потім, мабуть, М-білок (асоціює з внутрішньою поверхнею таких областей мембран, формуючи електронно-щільний шар. Далі з мембраною в цих областях специфічно зв'язується рибо-нуклеопротеїн і відбувається процес відокремлення шляхом згинання і випинання сегмента мембрани і оточення асоційованого рибонуклепротеіну. Дані електрофорезу в поліакриламідному гелі також підтримують ідею про те, що білки оболонки асоціюють з плазматичною мембраною швидше, ніж РНП (Lazarowitz et al., 1971). Поліпептиди клітини-хазяїна витісняються з мембрани, яка є попередником оболонки вірусу, так як подібні поліпентиди виявляються в очищених вирионах. Як уже згадувалося, залишки нейрамінової кислоти відсутні в оболонці відбруньковуватися частинок вірусу грипу, але присутні в сусідніх ділянках мембрани клітини (Klenk et al., 1970).

  Ці дані доводять різкий перехід в хімічному складі між оболонкою відбруньковуватися вірусної частинки і є сусідами мембраною клітини.

  Однак, з іншого боку, важливою особливістю процесу відбруньковування є те, що вірусна оболонка неперервна з плазматичною мембраною клітини-господаря і морфологічно подібна їй (Compans, Dimmock, 1969). Як було згадано, ліпіди в цих оболонках мають дуже близьку схожість з ліпідами мембрани клітини-хазяїна. Ці спостереження припускають, що ліпіди в незміненій плазматичної 'Мембрані легко обмінюються з ліпідами в відбруньковуватися вірусних частинках шляхом радіальної дифузії.

  Отже, оболонка відбруньковуватися віріона утворюється з невеликої ділянки мембрани клітини, модифікованого включенням білків оболонки віріона. Ця концепція, звичайно, не містить в собі необхідність синтезу 'всіх компонентів оболонки на плазматичній мембрані.

  Дійсно, протягом тривалого часу було відомо, що складові частини оболонки повинні мігрувати на значні відстані з однієї ділянки клітини в інші, щоб дістатися від місця свого біосинтезу: до місця збірки оболонки. Breitenield і Schafer (1957) показали, що в клітинах, заражених вірусом грипу, НА * спочатку можна уви-

  подіти у всіх частинах. клітини і що він ш підвищеної-концентрації локалізована в околоядерной зоні. Пізніше НА * накопичується в 'периферичної області «льотки, а також може бути продемонстрований в тонких нитках, які виступають з мембрани кльоші.

  Уявлення про те, що компоненти оболонки мігрують зсередини «льотки, до поверхні, недавно було підтверджено і розширено серією робіт з використанням фракціонування клітин та аналізу вірусних білків в різних фракціях клітин. Ці роботи також дають підставу припускати, що глікопротеїн НА, а можливо, і інші білки оболонки синтезуються на шорсткою ендоплазматіче-оком ретикулуме (Compans, 1973a; Klenk et al., 1974). Як виявляється в пульс-чейз-експериментах, через кілька хвилин НА виявляється вже в мембранах гладкого ендо-плазматичного ретикулума (Compans, 1973a; Stanley et al.,. 1973; Klenk et al., 1974) і в плазматичній мембрані (Stanley et al ., 1973). Хоча досліди по Чейзу з гладкого ендоплаз-автоматично ретикулума в плазматичну мембрану і не були проведені, здається правдоподібним, що НА мігрує з шорсткого ендаплазматіческого ретикулума ас плазматичної мембрані, минаючи гладкий ендошгазматіче-ський ретикулум. Слід зазначити, що протягом усього часу такої міграції НА та інші білки оболонки є складовими частинами мембран, уздовж яких вони рухаються; ОБІ ніколи не виявляються у вигляді розчинених білків.

  У фракціях гладких мембран, які, як вважають, походять головним чином з ендоплазматнческого ретикулума, знаходять всі основні білки оболонки (Compans 1973a; Klenk et al., 1974). Проте їх відносні. Кількості тут відрізняються від таких у плазматичній мембрані і вир іоні (Stanley et al., 1973; Klenk et al., 1974). Співвідношення М-білка до ллікопротещдам НА більш високе в оболонці зрілого віріона, ніж в мембранах ендоллазматічеокого ретикулума. Ці дані дозволяють припустити, що лише невелика кількість мембран, несучих глікопротеїн НА, перетворюється на вірусну оболонку, а саме фракції мембран, до складу яких входять л білки, вільні від вуглеводів. Як вже вказувалося, синтез М-білка може бути тією стадією, яка лімітує процес складання. Вірусу.

  Різниця швидкості синтезу різних білків оболонки підтримує 'гіпотезу про те, що збірка оболонки-процес багатостадійний. З цією концепцією узгоджується питання про процес утворення НА *, що включає послідовне приєднання вуглеводної частини і протеолітичну розщеплення в ході міграції первинного генного 'продукту.

  VIII. ЗВІЛЬНЕННЯ ВІРУСУ ГРИПУ

  Проблема звільнення вірусу грипу з клітки-господаря,

  мабуть, тісно пов'язана з проблемою функції вірусної

  NA *, про яку вже детально говорилося раніше (див. раз

  справ V і гол. 4). Те, що цей фермент відіграє істотну

  роль у звільненні вірусу, випливало з здібності анти

  тел, специфічних до NA *, придушувати таке звільнення (Se-

  to, Rott, 1966; Webster et al., Г968). До того ж такі антитіла

  запобігають елюція вірусу з еритроцитів (Brown, Laver,

  1968). Бактеріальна NA *, яка не інгібує антіте

  лами до вірусної NA *, здатна звільняти вірус від клітин,

  оброблених такими антитілами (Compans et al., 1969;

  Webster, 1970). З іншого боку, двовалентні антитіла

  до NA також викликають агрегацію вірусу (Seto, Chang, 1969;

  Compans et al., 1969; Webster, 1970), а одновалентні анти

  тіла не перешкоджають звільненню вірусу, хоча інгібують

  більше 90% активності нейрамінідази (Becht et al., 1971).

  Всі ці дані, разом узяті, дозволяють припустити, що

  двовалентні антитіла перешкоджають звільненню вірусу

  шляхом зв'язування його з антигенами, присутніми на по

  верхности клітини, і шляхом інгібування активності фер

  мента. Роль нейрамінідази у звільненні вірусу показу

  Чи також Palese і еоавт. (Г974), які встановили, що цей фер

  мент необхідний для видалення нейро амилового кислоти з ві

  РУСН поверхні щоб уникнути агрегації віріонів-потом-

  ков на поверхні клітини.

  IX. НЕПРАВИЛЬНІ ФОРМИ РОЗМНОЖЕННЯ

  А. абортивного РОЗМНОЖЕННЯ, залежними від клітини-хазяїна

  Віруси грипу можуть заражати широкий набір клітин-господарів. Однак у багатьох із заражених клітин вихід інфекційного потомства або дуже низький, або взагалі не 'Визначається, хоча вірусні компоненти можна виявити в звичайних титрах. Цей тип залежного від клітини-хазяїна переривання інфекційного циклу називають абортивної інфекцією. Такий абортивний інфекційний цикл спочатку спостерігали у мишей, заражених у мозок ненейротропньші штамами вірусу грипу (Schlesinger, 1953). Чим вище була вводиться доза вірусу, тим-більше було кількість знову синтезованого гемаглютиніну. Було описано декілька інших систем клітина-господар-вірус грипу А, в яких продукувались тільки РНП-^ антиген і гемаглютинін, але не інфекційний вірус. У всіх цих досліджених до цих лор системах РНП-антиген накопичувався в ядрі і не обготівковув-

  руживается за допомогою флуоресцентних антитіл в цитоплазмі (Henle et al., 1955; Franklin, Breitenfeld, 1959; Ter Meulen, Love, 1967; Fraser, 1967).

  Б. ФЕНОМЕН ФОН-Магнус

  У процесі серійних пасажів 'вірусів грипу при множинності вище, ніж 1 (Barry, 1961), утворюються збільшуються-кількості неповного вірусу, що виходить з. клітини-хазяїна (von Magnus, 1951, 1952). Ці вірусні частки мають поверхневу структуру, дуже схожу на. структуру інфекційного вірусу, є імуногенними: і викликають гомологичную інтерференцію. Вони містять менше РНК і РНП-антигену, виявляють меншу величину відносини інфекційності до гемагглютінірующей активності і містять більше ліпідів, ніж повні вірусні частки (von Magnus, 1954; Isaacs, 1959; Pauker et al., 1959; Rott,. Schafer, 1961; Rott, Scholtissek, 1963).

  При аналізі РНК неповного вірусу виявлено, що вірусна РНК з відносно високою [молекулярною масою або відсутній або присутній в них в зменшених кількостях, тоді як кількість РНК з низькою молекулярною масою збільшується (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969; Nayak, 1969) .

  У клітинах, заражених другий нерозведеним пасажем вірусу грипу,. Присутня вся генетична інформація вірусу, оскільки вкРНК, виділена з цих «вічко, здатна перетворювати після гібридизації мічену РНК, виділену з інфекційного вірусу, в повністю РНК-азорезі-стентную форму (Scholtissek, Rott , 1969b). Таким чином, збільшення. Кількості РНК з низькою молекулярною масою в неповних частинках. Може шроісходіть за рахунок РНК з великою молекулярною масою, яка може включатися в ці частинки у вигляді зруйнованих і, отже, нефункціо-нірующіх молекул. Ця ідея підтримується даними, що з жагою нерозведеним пасажем перш © сього падає здатність продукувати інфекційний вірус, після чого зменшується синтез гемаглютиніну, нейрамінідази і, нарешті, РНП-антигену (Scholtissek et al., 1966).

  Nayak (1972) встановив, що протягом першого пасажу з високою множинністю вірус, що виходить спочатку, був повністю інфекційні та давав у сахарозний градієнті нормальну картину фрагментів РНК інфекційного вірусу, тоді як вірус, що виходить пізніше, мав профіль РНК, типовий для неповного (фон -магнусовокого) віруса1. 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Реплікація вірусу грипу"
  1.  Кільбурн Е.Д.. Віруси грипу та грип (1978), 1978
      Книга присвячена огляду різноманітних вірусів грипу, їх культивування, біохімії і особливостям молекулярного пристрою. Зміст: Віруси грипу та грип. Структура вірусу грипу. Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін. Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу. РНК вірусів
  2.  Віруси грипу та грип
      Е. Д. Кільбурн (Е. D. KILBOURNE) I. ВСТУП. ГРИП - ЗАХВОРЮВАННЯ З Незмінних симптоматики, викликає Змінюється ВІРУСОМ Величезний інтерес, який притягається до сучасної вірусології до грипу і вірусів, відповідальним за його виникнення, вимагає пояснення, якщо врахувати ординарний характер симптоматики цього, зазвичай дуже помірного, інфекційного захворювання дихальних шляхів
  3.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу
      Д. Букера і П. ПАЛЕЙЗІ (BUCHER, P. PALESE) I. ВСТУП Існування нейрамінідази вперше припустив в що стала нині вже класичній роботі Hirst (1942). Він виявив, що якщо агглютінірованних у присутності'іруса грипу еритроцити деагглютініровать, то при додаванні до них 'нового вірусу вони знову не здатні до аглютинації. При цьому, однак, елюіровать вірус не
  4.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу
      Р. В. ОІМПСОН і В. Д. БІН (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. ВСТУП Ця глава «освячена досить новому розділу в біології вірусу грипу, у зв'язку з чим більша частина інформації фрагментарна по-своєму складу сі включає велике число невирішених питань. Основне твердження, на якому грунтується дана глава, полягає в тому, що мікоовіруси є вірусами з негативним геномом
  5.  Культивування вірусів грипу людини в лабораторних умовах, коло господарів серед лабораторних тварин і виділення вірусу з клінічного матеріалу
      В. Р. Даудл і Г. С. ШИЛД (WR DOWDLE, G. С. SCHILD) I. ВСТУП Вперше пасаж вірусу грипу в експерименті був здійснений на початку століття при роботі з ВЧП, проте до 1955 р. він не'бил віднесений до вірусів грипу (Schafer, 1955). У 1931 р. Shope пасеровані «. Класичний» грип на свинях шляхом інтраназального введення їм фільтрату виділень з респіраторних шляхів. Перші дані про
  6.  ПРИНЦИПИ ПРОТИВІРУСНОЇ ХІМІОТЕРАПІЇ
      Рафаел Долін (Raphael Dolin) Вступ. Використання противірусних з'єднань для хіміотерапії та хіміопрофілактики вірусних хвороб являє собою відносно новий розділ у вченні про інфекційні хвороби, особливо якщо порівняти його з більш ніж 40-річним досвідом використання протибактерійних антибіотиків. Принципи, що лежать в основі застосування противірусних з'єднань, були
  7.  РНК вірусів грипу
      М. В. Лонсі (М. W. PONS) I. ВСТУП Вірус грипу має унікальний в порівнянні з іншими вірусами тварин спектр біологічних властивостей. Він має здатність. До множинної реактивації (Hoyle, Liu, 1951), утворення неповних вірусних частинок (von Magnus, 1954), чутливий до антіноміціну D (Barry et al., 1962), його нуклеїнова кислота неінфекційні-і він має здатність до
  8.  Антигенна мінливість вірусу грипу
      Р. Г. Вебстера і У. Г. ЛЕІВЕР i (RG WEBSTER and WG LAYER) I. ВСТУП Вірус грипу типу А1 є унікальним серед 'збудників інфекційних захворювань людини внаслідок своєї здатності настільки сильно змінювати власну антигенну структуру, що специфічний імунітет, набутий у відповідь «а зараження одним штамом, дуже слабо або зовсім не захищає від наступного
  9.  Імунологія грипу
      Дж. Л. ШУЛЬМАН (J. L. SCHULMAN) I. ВСТУП Незважаючи на 40-річний період інтенсивного лабораторного вивчення і майже такий же період,: впродовж якого розробляються вакцини проти трііпа людей, існують величезні прогалини в нашому. Розумінні імунних механізмів при грипі. Ця неповнота наших знань значною мірою є наслідком унікальною і приголомшливою здатності
  10.  Грип у людини
      Р. Г. ДУГЛАС (RG DOUGLAS) ВСТУП Завданням цього розділу є опис інфекції, спричиненої вірусом грипу у людини, так як саме захворюваність «смертність при цій інфекції роблять грип настільки серйозною проблемою для медицини і охорони здоров'я. Характер цієї книги не (дозволяє детально обговорити лікування та диференційну діагностику, як це робиться в 'медичних довідниках.
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...