Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
ГоловнаМедицинаОнкологія
« Попередня Наступна »
Петренко А.А. Аналіз метилування ДНК при раку шийки матки, 2003 - перейти до змісту підручника

Полімеразна ланцюгова реакція

Праймери.

При виборі праймерів, для підвищення специфічності ПЛР, необхідно слідувати деяким вимогам. Так, довжина праймера повинна бути від 18 до 40 нуклеотидів в залежності від призначення. Слід уникати появи вторинних структур в праймері і більше трьох-чотирьох однакових нуклеотидів поспіль. Використовувані в одній реакції праймери не повинні мати комплементарних ділянок. Для оцінки структури праймерів ми використовували комп'ютерну програму Oligo 4.1 Primer Analysis Software. Склад праймерів, використаних в даній роботі, наведено в таблиці 2.

Таблиця 2.

Праймери

.



Температура відпалу визначає жорсткість умов гібридизації праймерів з мішенню і, отже, специфічність ампліфікації; вона

залежить від довжини праймерів і їх GC-змісту. Для приблизної оцінки температури відпалу ми використовували наступну формулу:

4оС х (G + C) + 2oC х (A + T) - 4. Точне значення температури підбирали експериментальним шляхом, використовуючи температурний градієнт.

Метілчувствітельная ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами.

Оброблену метілчувствітельнимі рестриктазами геномную ДНК (50-100 нг) ампліфікували методом ПЛР з використанням як одного статистичного GC-багатого праймера, так і у випадку СП-2 і СП-3 їх комбінації. Використані в нашій роботі статистичні GC-багаті праймери наведено в табл. 2. Реакцію проводили в кінцевому обсязі 25 мкл в наступних умовах: 1X буфер для ПЛР, 1.5 мМ MgCl2, 200 мкМ кожного з чотирьох дезоксинуклеотидов-трифосфатов, 25 пмоль праймера та 1 од. акт. Taq ДНК-полімерази ("НДІ біоорганічної хімії", Росія). У разі радіоактивного мічення продуктів ПЛР в реакцію додавали 2 мкКі a-33P-dATP. Перші 5 циклів реакції проходили в «м'якому» режимі: 94oC 30 сек, 40 ° C 60 сек, 72 ° C 90 сек. Протягом наступних 30 циклів амплификацию проводили в специфічному режимі: 94 ^ 15 сек, відповідна для даного праймера (див. табл. 2) 15 сек, 72 ^ 60 сек (Gonzalgo et al., 1997). Продукти ПЛР аналізували в високоразрешающем 5% поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах. ДНК виявляли методом сріблення, якщо не проводили мічення продукту ПЛР (див. п. 8.3.), Або експонуванням гелю з рентгенівською плівкою протягом 14 днів.

Виділену з поліакріламідного гелю ДНК (див. п. 8.1.) Ампліфікували з використанням відповідного праймера. Реакцію проводили в специфічних умовах описаних вище. ПЛР здійснювали протягом 30 циклів у наступному режимі: 94 ^ 30 сек, відповідна для праймера (див. табл. 2) 30 сек, 72 ^ 60-180 сек. Час елонгації визначалося розміром амплифицируемого фрагмента ДНК. У ряді випадків реакцію проводили у присутності 10% гліцерину або 5% ДМСО. Якісну і кількісну оцінку продукту ПЛР проводили методом електрофорезу в агарозному гелі, порівнюючи з відомим кількістю ДНК-маркера X PstI. Для клонування використовували аліквоту продукту ПЛР без попереднього очищення.

Метілчувствітельная ПЛР зі специфічними праймерами.

Оброблену метілчувствітельнимі рестриктазами геномную ДНК (50-100 нг) ампліфікували з використанням ген-специфічних праймерів (табл. 2). Реакцію проводили в кінцевому обсязі 25 мкл в наступних умовах: 1 буфер для ПЛР, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ кожного з чотирьох дезоксинуклеотидов-трифосфатов, 10 пмоль кожного праймера та 1 од. акт. Taq ДНК-полімерази ("НДІ біоорганічної хімії", Росія). Ампліфікація проходила при наступному режимі: 94 ° C 15 сек, відповідна для пари праймерів (див. табл. 2) 30 сек, 72 ^ 40-60 сек, - 30-35 циклів. У разі праймерів до гену / З3Л-адаптіна реакцію проводили у присутності 5% формамід. Виявлення продуктів ПЛР проводили методом електрофорезу в агарозному гелі.

Метілспеціфіческая ПЛР.

Метілспеціфіческую ПЛР проводили в два етапи за принципом полугнездовой ПЛР. На першому етапі ДНК після бісульфітной модифікації ампліфікували з використанням праймерів adpt-bis-1 і adpt-bis-3 в кінцевому обсязі 50 мкл в наступних умовах: 1 буфер для ПЛР, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ кожного з чотирьох дезоксинуклеотидов-трифосфатов, 10 пмоль кожного праймера та 1 од. акт. Taq ДНК-полімерази ("НДІ біоорганічної хімії", Росія). Ампліфікація проходила в наступному режимі: 94 ^ 30 сек, 50 ^ 60 сек, 72 ^ 90 сек, - 35 циклів. На другому етапі використовували аліквоту ампліфіката з першої ПЛР, нерозведеною або розведеної бідістілірованной водою у співвідношенні 1:10. Також замінювали праймер adpt-bis-1 на праймер adp-bis-2. Реакцію проводили в кінцевому обсязі 50 мкл в описаних вище умовах.

Ампліфікація проходила в наступному режимі: 94 ^ 30 сек, 52 ^ 30 сек, 72 ^ 60 сек, - 30 циклів. Продукти ПЛР аналізували за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. При наявність продукту ПЛР відповідного розміру, проводили його виділення з агарози. Кількісну оцінку очищеного продукту ПЛР здійснювали методом електрофорезу в агарозному гелі, порівнюючи з відомим кількістю ДНК-маркера X PstL Визначення нуклеотидної послідовності досліджуваного продукту ПЛР проводилося на автоматичному сіквенаторе в інституті Молекулярної біології ім. Енгельгардта, Росія.
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
Інформація, релевантна " полімеразна ланцюгова реакція "
  1. мікоплазмоз
    Урогенітальний мікоплазмоз - інфекційне захворювання, що передається статевим шляхом. В еволюційному сенсі мікоплазми являють собою пів-ністю стабілізувалася, позбавлені клітинної стінки бактерії, на-що ходять на проміжній ступені між рикетсіями і вірусу-ми. Відсутність клітинної стінки у мікоплазм призвело до їх високої плейоморфності. Розміри мікоплазм коливаються від 300 нм до
  2. . Методи дослідження
    Віруси як внутрішньоклітинні паразити не спо собни рости на штучних поживних середовищах. Вони можуть розмножуватися тільки в організмах сприйнятливих господарів (in vivo) або в живих чутливих до вірусу клітинах (in vitro). Організм сприйнятливого господаря для дослідження вірусів використовується в тих випадках, коли немає експериментальних систем in vitro, для вивчення
  3. Хламідіоз великої рогатої худоби
    Хламідіоз (chlamidiosis of cattle) - інфекційна хвороба, що характеризується абортами, ендометритами, вагінітами, народженням мертвих і нежиттєздатних телят, енцефаломієліту, поліартритами, коньюнктивитами, пневмоніями, ентеритами, маститами, орхітамі, уретритами, баланопоститом і латентним перебігом. Хвороба може протікати як з різноманітними клінічними ознаками у одного виду тварин,
  4. Методи діагностики заразних хвороб
    Бактеріологічне дослідження застосовується для виявлення патогенних бактерій в матеріалі від хворих тварин або їх трупів , виявлення мікробів в об'єктах зовнішнього середовища, кормах, м'ясі і т.д. Досліджуваний матеріал по можливості збирають в асептичних умовах у стерильний посуд (від трупів не пізніше 2-3 годин після смерті тварин, у ряді випадків доцільний вимушений забій 1-2-х з
  5. сибірка
    Сибірська виразка (лат. - Febris carbunculosa; англ. - Anthrax) - особливо небезпечна, гостра септична хвороба тварин багатьох видів і людини, що викликається Bacillus anthracis, характеризується септицемією, ураженням шкіри, кишечника, легенів, лімфатичних вузлів і загибеллю хворих тварин (див. кол. вклейку). Історична довідка, поширення, ступінь небезпеки і збиток. Сибірська виразка відома
  6. САП
    Сап (лат. - Malleus; англ. - Glanders) - хронічна хвороба коней, ослів, мулів та інших непарнокопитних родини конячих, що характеризується утворенням специфічних сапних вузликів, схильних до некрозу (див. кол. вклейку). Історична довідка, поширення, ступінь небезпеки і збиток. Перші згадки про сапі як про заразної хвороби наведені в працях Аристотеля в IV ст. до н. е.. Але
  7. ХЛАМІДІОЗ КОШЕК
    Хламідіоз кішок - інфекційна хвороба, що характеризується ураженням центральної нервової системи, сечостатевої сфери, абортами, кон'юнктивітом, а також захворюванням органів дихання і травлення. Історична довідка, поширення, ступінь небезпеки і збиток. Уперше про захворювання кішок кон'юнктивітом, пневмонією та іншими захворюваннями хламідійної природи повідомили Бейкер і Целль (1971). І.
  8. ХЛАМІДІОЗ
    Хламідіоз - заразна хвороба, викликана хламідіями, облігатними внутрішньоклітинними паразитами, які володіють ригидной клітинною стінкою, але за будовою займають якесь проміжне положення між бактеріями і вірусами. Загалом, за даними М.В.Макеевой (2001), носійство хламідій виявляється приблизно у 70% кішок. Відповідно до нової класифікації хламідій (Ямнікова С.С., Федякіна І.Т.,
  9. Організаційно-карантинні заходи
    1. Обмеження контактів з територіями, неблагополучними по ДП: при виявленні в країні ВГП незалежно від його антигену заборона ввезення птахівницької продукції з відповідної країни або її частини; дозволяти імпорт продукції птахівництва з неблагополучних регіонів через 6 міс. після ліквідації останнього випадку грипу, викликаного високовірулентних штамом збудника; при виникненні
© medbib.in.ua - Медична Бібліотека