загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Пошук CpG-острівців, гіперметілірованних в пухлинах шийки матки

Принцип методу метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-

багатими праймерами. Завданням нашого дослідження було виявлення CpG-острівців, метильованих в пухлинах шийки матки. Для її вирішення ми використовували метод метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами (СП-ПЛР) (Gonsalgo et al. 1997). Принцип методу полягає в наступному. ДНК з двох порівнюваних зразків (у нашому випадку з пухлинної тканини і лейкоцитів або прилеглої до пухлини морфологічно нормальної тканини, взятих

від одного і того ж пацієнта) обробляли мелкощепящей рестрикційної ендонуклеазою (рис. 5А), в

<- 3'-GCGCCCAATCCCACTCCCAA-5 'Малюнок

5. Схематичне зображення методу метил-чутливої ??ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами

. Кружком позначений сайт МЧР: О - Сайт не метилірованої, ф - сайт метилірованої. А. Схема експерименту; Y - статистичний GC-багатий праймер. Б. Приєднання статистичного праймера до CpG-багатому району ДНК. Вертикальними рисками позначені CpG динуклеотид. Стрілки вказують напрямок синтезу ДНК.

Сайті впізнавання якої немає CpG динуклеотидів. Ми в своїй роботі використовували ферменти Rsal і Msel. Їх застосування дозволяє отримати CpG-острівці в складі порівняно невеликих фрагментів геномної ДНК. Це підвищує ймовірність подальшої ампліфікації CpG-острівців, так як невеликі GC-багаті фрагменти ДНК амплифицируют краще, ніж великі. У теж час більшість CpG-острівців залишаються після обробки такими рестриктазами неушкодженими. Потім оброблену ДНК знову піддавали рестрикції, але вже з використанням так званих метілчувствітельних рестриктаз (МЧР), відмінною рисою яких є дві властивості. По-перше, такі ферменти мають у складі своїх сайтів рестрикції один і більше CpG динуклеотидів, тому CpG-острівці містять підвищену кількість сайтів цих рестриктаз в порівнянні з рештою ДНК. По-друге, МЧР працюють в залежності від статусу метилювання певного CpG динуклеотид в сайті рестрикції. Так, вони не здатні рестріціровать свій сайт, якщо цитозин у складі цього CpG динуклеотид метилірованої. Саме це властивість МЧР дозволяє проводити диференційний аналіз статусу метилювання CpG-острівця. Таким чином, використання МЧР з одного боку підвищує ймовірність виявлення саме CpG-острівця, а з іншого визначити його статус метилювання.

Далі всі варіанти оброблених рестриктазами ДНК з пухлинної і нормальної тканини ампліфікували з використанням статистичних GC-багатих праймерів. Ці праймери являють собою олігонуклеотиди, підібрані до середньостатистичної послідовності ДНК, за винятком 3 'кінця, який складається з 5-6 залишків цитозину і гуаніну в різній комбінації (зазвичай розташованих випадковим чином, але можуть являти собою і послідовність сайту якої-небудь МЧР, наприклад SacII в праймері СП-2). Наявність такого 3 'кінця призводить до того, що в неспецифічних умовах (при досить низьких температурах відпалу) відбувається краща гібридизація праймера з GC-

багатими областями ДНК (рис. 5Б). Так досягають збагачення продуктів ПЛР фракцією GC-багатих послідовностей, що включає також і CpG-острівці.

Після ампліфікації ПЛР продукти розділяли в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах. Для детекції продуктів ми використовували два методи. Перший є стандартним і увазі застосування

33



міченого нуклеотиду при проведенні ПЛР. Ми використовували a-P-dATP. Надалі, після поділу, продукти виявляли, експонуючи гель з рентгенівською плівкою. Альтернативним методом ідентифікації є сріблення фрагментів ДНК безпосередньо в поліакриламідному гелі (реакція срібного дзеркала). Незважаючи на більш низьку чутливість в порівнянні з першим методом, він дозволяє ефективно виявляти відносно довгі продукти реакції (300-1000 п.н.). На малюнку 6

Малюнок 6.

Порівняння двох методів візуалізації продуктів ПЛР в ПААГ

. А. Радіоавтографія ПААГ з радіоактівномеченнимі продуктами ПЛР. Б. Сріблення фрагментів ДНК безпосередньо в ПААГ. Стрілкою вказано фрагмент, взятий в подальше дослідження. Числа вгорі малюнка позначають номери зразків, де Л-ДНК з лейкоцитів, О - ДНК з пухлини шийки матки. Рестрикція зразків ДНК MseI (M); MseI / HpaII / HhaI (H).

Представлені результати типового досвіду в порівнянні двох способів візуалізації продуктів ПЛР в поліакриламідному гелі. Стрілкою зазначений той же фрагмент, виявлений як сріблення, так і за допомогою радіоактивної мітки. Таким чином, метод сріблення дозволяв нам надійно ідентифікувати фрагменти ДНК в діапазоні від 300 до 1000 н.п., що, згідно загальноприйнятим критеріям (Gardiner-Gardner and Frommer 1987), відповідає розмірам CpG-острівців. У разі продуктів коротше 300 п. н. радіоізотопний метод більш чутливий, ніж сріблення.

Основними перевагами методу СП-ПЛР є простота виконання і відносна дешевизна. До головних недоліків методу слід віднести той факт, що він виявляє GC-багаті послідовності, не всі з яких представляють собою CpG-острівці. Причиною цьому служать праймери, які не можуть диференціювати CpG-острівці і амплифицируют все GC-багаті послідовності. Тому нами були внесені модифікації, що підвищують ймовірність виявлення CpG-острівців. Відомо, що скупчення сайтів редкощепящіх МЧР вказує на присутність CpG-острівця (Bird 1986). У зв'язку з цим використання одночасно декількох крупнощепящіх ферментів метілчувствітельной рестрикції підвищує ймовірність ідентифікації CpG-острівця. Тому, поряд з звичайно застосовуються мелкощепящімі метілчувствітельнимі ендонуклеазами (HpaII, Hhal) ми використовували крупнощепящіе ферменти (SmaI, SacII, NarI). При цьому недоліком використання МЧР є можливість неповного розщеплення сайту рестрикції. Хоча для вирішення цієї проблеми ми застосовували двоетапну обробку ДНК МЧР (див. розділ "Матеріали і методи", п. 5), підтвердження статусу метилювання виявлених фрагментів вимагає додаткових досліджень.

Зазвичай при порівняльному аналізі ДНК з пухлинних і нормальних клітин методом МЧ-ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами в гелі присутні три типи продуктів ПЛР (рис. 7).

Перший тип продуктів присутня в ДНК, як нормальних тканин, так і пухлин незалежно від того, оброблена чи ДНК метілчувствітельнимі ферментами чи ні. У цьому випадку можливі два варіанти. Або ампліфіціруемого фрагменти ДНК не містять сайтів метілчувствітельних рестриктаз, або ж ці сайти присутні, але

метиловані у всіх досліджуваних ДНК. Такі продукти ПЛР зустрічаються найбільш часто. Другий тип продуктів присутня в ДНК, необроблених метілчувствітельнимі рестриктазами, і відсутній в ДНК, оброблених ними, незалежно від того з пухлин або нормальної тканини вони виділені.

Такий стан пояснюється тим, що в ампліфіціруемого послідовностях є неметілірованние сайти впізнавання, які розщеплюються рестриктазами, і, отже, запобігає поява продуктів ПЛР. Ці послідовності найбільш вірогідні кандидати на роль CpG-острівців. Вони зустрічаються набагато рідше продуктів першого типу. І, нарешті, існує третій тип продуктів, відсутній в ДНК з нормальних клітин і присутній в ДНК з деяких пухлин.

Причому дане відмінність існує тільки для ДНК, оброблених метілчувствітельнимі рестриктазами. У цьому випадку сайти впізнавання в ампліфіціруемого послідовностях є, але вони метиловані в деяких пухлинах на відміну від нормальних тканин. Такі продукти ПЛР зустрічаються ще рідше, але оскільки вони мають виключне метилирование тільки в пухлині, ці фрагменти, по суті, і є предметом пошуку та подальших досліджень.

I. II. III.



Малюнок 7.

Схема типів продуктів ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами, що зустрічаються в ПААГ

. МЧР - метілчувствітельная рестриктаза; Н-прилегла нормальна тканина, О - пухлина. Кружком позначений сайт МЧР: О - Сайт не метилірованої, ф - сайт метилірованої.

Типовий результат порівняльного аналізу ДНК з пухлинних і нормальних клітин методом МЧ-ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами представлений на малюнку 8. Тут видно, що більшість чітко

ідентифікованих фрагментів розташовується в районі від 300 до 800 п.н. і є продуктами першого і другого типу (відзначені стрілками). Також можна помітити, що продукти першого типу зустрічаються частіше, ніж другі.

Приклади продуктів третього типу представлені на рисунку 9.

234 235 243 2500 275 289



-200 ні

Н О Н О Н О Н О Н О Н О RNRNRNRNRNRNRNRNRNRNR NRN

Малюнок 8.

Аналіз продуктів ампліфікації ДНК з пухлинних і нормальних клітин за допомогою СП-ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами СП-2 і СП-3

. Фотографія гелю з продуктами ПЛР, забарвлених срібленням. Числами вверху малюнка позначені номери зразків, де Н - ДНК з нормального епітелію; О - ДНК з пухлини шийки матки. Рестрикція зразків ДНК RsaI (R); RsaI / NarI (N).
трусы женские хлопок
Стрілками зазначені: i=>-продукт ПЛР першого типу; - продукт ПЛР другого типу. Числами справа вказані розміри маркерних фрагментів.



Ферментами, що містяться в полілінкерамі. Слідом за цим проводили сиквенс клонів.

Після секвінірованія був проведений аналіз отриманих послідовностей. По-перше, досліджувані фрагменти локалізовувалися в геномі людини. При негативному результаті пошук проводили в геномах інших хребетних. Для вирішення цього завдання ми використовували набір програм пошуку гомологий BLAST ® (див. розділ "Матеріали і методи", п. 14.1). По-друге, необхідно було встановити, чи є виявлена ??нами послідовність CpG-острівцем. Для цього ми використовували загальноприйняті критерії CpG-острівців (див. розділ "Матеріали і методи", п. 14.2).

Результати аналізу виявлених фрагментів представлені на малюнку 10 і в таблиці 4.

Фрагмент 18 локалізована в другому интроне гена LOC148870, розташованого на першій хромосомі в зоні 1p36.32 (Homo sapiens chromosome 1 reference genomic contig NT 004321, www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez / viewer.fcgi? val=NT_004321.12). Даний ген отриманий автоматичним комп'ютерним аналізом з використанням методу передбачення BLAST. Підтвердженням наявності гена служить існування гомології з послідовністю одного клона EST. Ген має продукт-гіпотетичний білок FLJ32825, функція якого невідома. За GC складом і показником Н / Т цей фрагмент належить до GC-багатим послідовностям і не є CpG-острівцем.

Фрагмент 30 розташований в локусі AL137850 дев'ятий хромосоми в зоні 9q31.3-33.3 (Homo sapiens chromosome 9 reference genomic contig NT_017568, www.ncbi.nlm.nih.gov / entrez / viewer.fcgi? val=NT_017568.10). Даний фрагмент також являє собою просто GC-багату послідовність.

Фрагмент 22. У базах даних не виявлено послідовності гомологичной цього фрагменту. При цьому аналіз вказує на його







* Ідентифікаційний номер в GenBank: 22 - AF218212, 26 - AF247736

** У разі фрагментів 26, 32, 34 і 36 даний показник наведено для всього CpG острівця

*** Повний розмір CpG острівця вказаний на підставі гомології у разі фрагмента 34 з геном LOC254722, у разі фрагмента 36 з 3.3-kb повтором, у разі фрагмента 26 після визначення нуклеотидноїпослідовності 5 'регуляторного району гена вза-адаптіна

приналежність до CpG-острівця. Звертає на себе увагу, що з усіх виявлених нами CpG-острівців фрагмент 22 володіє найбільш високою щільністю CpG динуклеотидів (63 на 563 п.н.).

Фрагмент 32 розташований в локусі AL137058 на тринадцятій хромосомі в зоні 13q32.2-33.3 (Homo sapiens chromosome 13 reference genomic contig NT 024524, www.ncbi.nlm.nih.gov / entrez / viewer. fcgi? val=NT 024524.10). Дана послідовність оточена з двох сторін повторами MER21B - 5 'і AluSx - 3', а сам фрагмент гомологічен CpG-острівця, який у свою чергу був виявлений за допомогою комп'ютерного аналізу (Sanger Centre Chromosome 13 Mapping Group, http://www.sanger .ac.uk/HGP/Chr13), проте ген, асоційований з цим CpG-острівцем, не визначений.

Фрагмент 34 був виявлений при клонуванні фрагмента 32, мабуть, в якості незначною домішки, невіддільний навіть у денатуруючих умовах при електрофорезі в ПААГ, імовірно за рахунок високого вмісту GC пар в обох фрагментах. Місцезнаходження фрагмента 34 в геномі - 3 'область гена LOC254722, розташованого на хромосомі Х (Homo sapiens chromosome X reference genomic contig NT 011786, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi? Val=NT_011786.10), отриманого комп'ютерним аналізом з використанням методу передбачення GenomeScan. Існування даного гена підтверджується гомологією з одним клоном EST. Фрагмент 34 містить у своєму складі частина послідовності CpG-острівця, який включає в себе кінець останнього интрона, останній екзон гена і нетранскрібіруемую межгенного послідовність.

Фрагмент 36. При аналізі нуклеотидноїпослідовності цього фрагмента було встановлено, що він гомологічен близькоспоріднених один одному областям з тандемними 3.3-kb повторами, розташованим в прітеломерних областях хромосоми 10 (зона 10q26.3) і хромосоми 4 (зона 4q35, поліморфний район D4Z4). Так в локусі D4Z4 виявляють від 10 до

  100 тандемних 3.3-kb повторів. Кожна копія повтору містить ген DUX4, що відноситься до сімейства генів DUX, що кодують транскрипційні фактори з двома гомеодоменамі (Gabriels et al. 1999). Для локусу 10q26.3 хромосоми 10 на даний момент виявлено набір гіпотетичних генів, що мають напророчену комп'ютерним аналізом пептидную структуру, подібну гомеобоксних білкам. За своїми параметрами 3.3-kb повтор має властивості CpG-острівця (Access. No HUMFSHD http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&lis t_uids=00871846 & dopt=GenBank) і належить до сімейства 3.3-kb повторів, асоційованому з областями гетерохроматина. Крім прітеломерних областей хромосом 4 і 10 члени цього сімейства розташовуються на короткому плечі всіх акроцентричних хромосом і в періцентромерной області хромосоми 1 (див. van Geel et al. 2002).



  Фрагмент 26. При пошуку гомологий з відомими послідовностями з'ясувалося, що перші 127 н.п. (Фрагмент А, рис. 11) мають гомологію з 5 'кінцем кДНК гена вза-адаптіна (AP3B1: adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit). Наступні 93 н.п. (Фрагмент Б) не мали гомологий з відомою послідовністю, а останні 45 н.п.



  1 екзон 1 интрон 2 екзон

  H Sc H N Sc H

  CpG острівець -4-26-3 100 п.н.

  Малюнок 11.

 Схематичне зображення розташування відносно один одного першого екзона гена

 вза-адаптіна, фрагмента 26 і раніше виявленого CpG острівця (Cross et. al., 1994). Вертикальна риса позначає місце розташування сайтів метілчувствітельних рестриктаз: H - HpaII; Sc - ScaII; N - Narl;

  - Фрагмент А, ЕЕ - фрагмент Б, ЕЕ - фрагмент В, - невідома послідовність. Стрілками позначені праймери.

  (Фрагмент В) перекриваються з послідовністю, яка раніше була виявлена ??іншим методом як CpG-острівець (Cross et al. 1994).

  Знаходження фрагмента 26 і цього CpG-острівця в складі єдиної послідовності ми підтвердили отриманням загального продукту ампліфікації ДНК з клітин HeLa за допомогою праймерів 26-1 і 26-3 і його наступним секвенуванням. Так як на той момент була відома тільки кДНК цього гена, і був відсутній повний сиквенс ДНК цього району, з отриманих результатів слід було, що фрагмент А є частиною першого екзона, а фрагмент Б і раніше виявлений CpG-острівець представляють собою початок першого интрона. Зіставлення нуклеотиднихпослідовностей виділеного нами фрагмента ДНК і кДНК гена показало, що до складу першого екзона входять 220 н.п., далі йде канонічний донорний сайт сплайсингу (GT), а наступні 362 н.п. не мають гомології з послідовність кДНК і являють початок першого интрона. Після появи і анотування в базах даних повної послідовності ДНК гена (Homo sapiens chromosome 5 reference genomic

  contig NT_006713,

  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NT_006713.10) виявилося, що розмір першого екзона дійсно становить 220 н.п., а перший интрон починається з встановленою нами послідовності і має довжину 26856 н.п. Таким чином, встановлені нами межі першого екзона і опубліковані пізніше дані по анотування генома людини збіглися.

  Незважаючи на невелику довжину, фрагмент 26 має властивості CpG-острівця (значення Н / Т становить 0.78, зміст GC одно 0.59). Також він виявився обмежений з обох сторін сайтом SacII. Даний фрагмент був виявлений за допомогою статистичного праймера СП-2, який має на 3 'кінці послідовність сайту SacII. Дійсно, в 5 'області гена вза-адаптіна є зона, де два сайти SacII розташовані на відстані 275 п.н., і саме ця зона і була ампліфікувати. З іншого боку аналіз показав, що CpG-острівець не обмежений рамками фрагмента 26. З досліджень параметра Н / Т і GC-складу слід, що до його складу входять весь перший екзон і початок першого интрона. З 3 'кінця він обмежений повтором HERVK14CI. На підставі цього можна зробити висновок, що CpG-острівець гена вза-адаптіна закінчується в першому интроне. Через відсутність повної послідовності ДНК гена вза-адаптіна неможливо було визначити, чи продовжується CpG-острівець в 5 'регуляторну зону. Це було зроблено експериментально (див. нижче).

  Таким чином, всі сім фрагментів ДНК, виявлених методом СП-ПЛР, виявилися GC-багатими послідовностями, а п'ять із них CpG-острівцями. При цьому вони є CpG-острівцями, не тільки по загальноприйнятим критеріям, а й за запропонованими останнім часом критеріям, які дозволяють виключити GC-багаті Alu-повтори: розмір послідовності більше 500 н.п., GC складу більш 0.55, ставлення експериментально визначеного числа CpG динуклеотидів до теоретично можливого (показник Н / Т) більш 0.65 (Takai and Jones, 2002). Звертає на себе увагу той факт, що серед п'яти відібраних CpG-острівців не виявилося послідовностей, асоційованих з Alu-повторами, ендогенними провірусами і рибосомальні генами.
 Можливо, що відсутність такого типу CpG-острівців пов'язано з неодмінною умовою відбирати тільки ті CpG-острівці, які змінювали статус метилювання в пухлинних клітинах в порівнянні з нормальними. Відбір диференційно-метильованих CpG-острівців проводили на невеликому числі парних зразків (групи з 7 і 8 пар зразків). Аналіз реального статусу метилювання у відносно великому числі пухлин і двох клітинних лініях карцином шийки матки був проведений для CpG-острівців 32 і 26.

  Визначення статусу метилювання CpG-острівця З2 при раку шийки матки.

  Аналіз статусу метилювання CpG-острівця 32 був проведений в 22 зразках пухлин шийки матки, 15 нормальних тканин шийки матки і 7 лейкоцитів периферичної крові тих же пацієнтів, і в двох клітинних лініях карцином шийки матки методом метил-чутливої ??ПЛР.

  Використовували два варіанти аналізу: одночасне розщеплення чотирьох (1 сайт NarI і 3 сайта HpaII) або шести (3 сайт HpaII і 3 сайта HhaI) сайтів впізнавання метілчувствітельних рестриктаз в ділянці CpG-острівця, який потім піддавався ампліфікації. У більшості пухлин, лейкоцитів і умовно нормальних тканинах і в двох клітинних ліній після



  обробки метілчувствітельнимі рестриктазами був присутній продукт

  271Л 271О 275Л 275О HeLa SiHa R RNH R RNH R RNH R RNH R RHHh R RHHh M

  451Н 451О 456Н 456О R RHHh R RHHh R RHHh R RHHh М __. . _ Щи ^ m ^ m m *-HULL

  -300ul

  Малюнок 12.

 Аналіз статусу метилювання CpG динуклеотидів

 , Що входять до складу сайтів рестрикції метілчувствітельних ферментів NarI, HpaII і HhaI в межах CpG острівця 32 методом МЧ-ПЛР. Рестрикція зразків ДНК RsaI (R); RsaI / NarI / HpaII (RNH); RsaI / HpaII / HhaI (RHHh). Числами вгорі вказані номери зразків, де Л - ДНК з лейкоцитів, Н - ДНК з нормального епітелію, О - ДНК з пухлини шийки матки; М-маркер 100 bp, числами справа вказані розміри маркерних фрагментів.

  ампліфікації, що говорить про метилировании всіх досліджуваних сайтів (рис. 12, зразки 271, 451, 456, клітки HeLa і SiHa). В одному з 22 зразків продукт ПЛР був відсутній (рис. 12, зразок 275). Наявність метильованих алелей досліджуваного CpG-острівця в більшості лейкоцитів, пухлинних і нормальних тканинах шийки матки дає підставу припускати, що CpG-острівець 32 може бути розташований в схильному імпринтингу локусі хромосоми 13. Як відомо, імпринтинг гена супроводжується метилированием CpG-острівця в одному з алелів гена і моноаллельной експресією гена в нормальних клітинах. Для пухлинних клітин характерна втрата імпринтингу, що супроводжується зміною статусу метилювання CpG-острівця в районі імпринтовані гена і порушенням

  моноаллельной експресії гена. Нещодавно було виявлено, що втрата імпринтингу гена IGF-II спостерігається не тільки в пухлинах кишечнику, але і в нормальних тканинах (лейкоцитах) цих же пацієнтів (Cui et al. 1998). Можливо, що відсутність метилювання CpG-острівця 32 у пацієнта 275 в пухлинної тканини і в лейкоцитах периферичної крові пов'язано з втратою імпринтингу.

  Таким чином, CpG-острівець 32 дійсно диференційно метилірованої в деяких пухлинних і нормальних тканинах. Припущення про те, що CpG-острівець 32 локалізована в схильному імпринтингу районі хромосоми 13, вказує на необхідність відповідного детального дослідження цього району в подальшому. На жаль CpG-острівець 32 поки не асоційований з яким-небудь геном. У цьому районі поки не виявлено рамок зчитування, підтверджених наявністю EST.

  Визначення повного розміру CpG-острівця гена / ЗА-адаптіна. Для подальшого дослідження ми обрали CpG-острівець гена вза-адаптіна, так як він виявився єдиним виявленим CpG-острівцем, асоційованим з відомим геном. У зв'язку з цим виникла задача встановити повну довжину CpG-острівця. Так як 3 'кінець CpG-острівця був відомий, нам необхідно було визначити його кордон в 5' області гена. Для цього ми використовували один з варіантів методу "прогулянки по геному". Схема досвіду представлена ??на малюнку 13А. Спочатку геномную ДНК обробляли за допомогою рестріктази, що утворює "липкі" кінці. При цьому був обраний фермент TaqI, що не має сайту рестрикції в відомої послідовність. Після цього отримані фрагменти лігували в концентрації, при якій вони переважно утворюють кільцеві структури (даний етап роботи був проведений співробітником лабораторії молекулярної біології вірусів Ешілевим Е.М., який люб'язно надав матеріал для клонування). Далі отримані фрагменти ДНК, замкнуті в кільце, ампліфікували за допомогою так званих інвертованих праймерів. Дані праймери були підібрані до відомої послідовності, проте вони орієнтовані в протилежні сторони. При використанні в якості матриці лінійної ДНК такі праймери продукту не дають, а при ампліфікації кільцевої молекули утворюють продукт, який містить у своєму складі наступні частини: праймер 1-5 'відома послідовність - 5' невідома послідовність - сайт рестрикції TaqI - 3 'невідома послідовність - 3 'відома послідовність - праймер 2. Після цього проводили клонування продукту ПЛР з подальшим секвенуванням у складі плазміди.



  А. ДНК

  Клонування і секвенування продукту ПЛР



  Б.

  26-11 26-5

  I \ -

  -426-12 -426-10 -426-8 426-2

  Малюнок 13.

 Схематичне зображення варіанта методу "прогулянка по геному".

 А. Схема досвіду; EZI - відома послідовність, | | | | - невідома послідовність,> - праймер. Б. Розташування використаних для клонування праймерів до відомої послідовності 5 'області гена / ЗА-адаптіна.

  Для отримання та дослідження невідомої 5 'області гена ми застосовували гніздову ПЛР з використанням двох пар інвертованих праймерів (рис. 13Б). Спочатку кільцеву ДНК ампліфікували з використанням праймерів 26-11 і 26-8. Потім проводили другий раунд ПЛР, де застосовували праймери 26-5 і 26-10. При цьому в якості матриці використовували реакційну суміш після першого ПЛР, як в нерозведеному вигляді, так і в розведенні 1:10. На малюнку 14А представлені результати



  Малюнок 14.

 Аналіз фрагментів ДНК, отриманих за допомогою інвертованих праймерів до гену РЗА-адаптіну

 . А. Результат електрофорезу в агарозному гелі продуктів другого раунду ПЛР; М - маркер X PstI. Б. Гібридизація продуктів другого раунду ПЛР з радіоактівномеченним праймером 26-2. Розведення матриці - продукту першого раунду ПЛР: 1 - нерозведений, 2 - розведення 1:10. Стрілкою вказано досліджуваний фрагмент. Числами справа вказані розміри маркерних фрагментів.

  електрофорезу в агарозному гелі продуктів ампліфікації після другого раунду ПЛР. Видно, що в гелі були присутні кілька смуг. Для виявлення продукту ПЛР, що містить необхідну нам послідовність, ми переносили ампліфіката на нітроцелюлозну мембрану і гібридизували з радіоактивно-міченим праймером 26-2, послідовність якого має бути присутня у продукті ПЛР, що містить відому область гена вза-адаптіна. Результати гібридизації показані на малюнку 14Б. Виявилося, що продукт з розміром 1966 п.н. і є шуканим. Він був клонований і секвенований.



  Малюнок 15.

 Розташування знову клонованого фрагмента в 5 'області гена

 / ЗА-адаптіна по відношенню до раніше відомим районам. А. Рестріктная карта 5 'області гена. Вертикальна риса позначає місце розташування сайтів метілчувствітельних рестриктаз: H - HpaII; Hh - Hhal; Sm - Smal; Sc - Scall; N - Narl. Б. Розподіл CpG

  динуклеотидів і розташування CpG острівця. - CpG острівець,? - Повтор, І-екзон, ЇЇ - интрон, ЇЇ - знову клонована послідовність. Вертикальна риса

  позначає одиничний CpG динуклеотид.

  В результаті цієї роботи ми визначили 5 'нетранскрібіруюмую послідовність гена (ЗЗА-адаптіна розміром 597 п.н. Аналіз об'єднаної послідовності 5' області гена (ідентифікаційний номер в GenBank - AF247736.2) дозволив визначити розмір його CpG-острівця, який склав 868 п . н. (рис. 15). Він включає в себе 56 CpG динуклеотидів і має наступні характеристики: значення параметра Н / Т одно 0.74, GC склад - 0.60. Найбільша щільність CpG динуклеотидів (24 з 56) і сайтів МЧР (13 з 20 ) спостерігається в 5 'нетранскрібіруемой зоні розміром 238 п.н., що безпосередньо примикає до першого екзонах. Наявність і положення Alu-повтору, що обмежує CpG-острівець з 5' боку, було визначено за представленою пізніше в базах даних нуклеотидноїпослідовності цього району хромосоми 5 .

  Таким чином, ми встановили повний розмір і послідовність CpG-острівця гена / ЗЗА-адаптіна, який розташовується в 5 'області гена і включає в себе нетранскрібіруемий район, перший екзон і початок першого интрона. При цьому він є CpG-острівцем, як за загальноприйнятими критеріями, так і за більш жорстким критеріям (див. вище). 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Пошук CpG-острівців, гіперметілірованних в пухлинах шийки матки"
  1.  Введення
      Актуальність теми: Рак шийки матки посідає друге місце серед усіх онкологічних захворювань у жінок. Етіологічним фактором раку шийки матки (РШМ) визнані віруси папілом людини (HPV) з так званої групи високого ризику (типи 16, 18 та інші). Після вірусної інфекції РШМ може розвинутися через стадії дисплазії, раку in situ впродовж декількох років, протягом яких у прогресію
  2. Г
      + + + Габітус (лат. habitus - зовнішність, зовнішність), зовнішній вигляд тварини в момент дослідження. Визначається сукупністю зовнішніх ознак, що характеризують статура, вгодованість, положення тіла, темперамент і конституцію. Розрізняють статура (будова кістяка і ступінь розвитку мускулатури): сильне, середнє, слабке. Вгодованість може бути гарною, задовільною,
  3.  Дослідження експресії і статусу метилювання гена Р3А-адаптіна при раку шийки матки
      Після встановлення повного розміру CpG-острівця гена вза-адаптіна ми провели дослідження взаємозв'язку між метилированием цього CpG-острівця і транскрипцією асоційованого з ним гена. Як відомо, метилирование CpG-острівця зазвичай супроводжується інактивацією транскрипції (див. розділ "Метилирование ДНК"). Тому завданнями нашого дослідження на даному етапі були вивчення рівня експресії
  4.  Гінекологічний огляд
      Процедура гінекологічного огляду складається з декількох етапів, послідовність яких може змінюватися в залежності від конкретної ситуації. Спочатку лікар розмовляє з жінкою і збирає дані анамнезу. Його цікавлять наявні скарги, вік приходу першої менструації (менархе), час початку статевого життя, її характер, а також особливості менструального циклу. Крім того, можуть бути задані
  5.  Запальні захворювання зовнішніх статевих органів у дівчаток і дівчат
      Визначення поняття. Запальні захворювання геніталій у дівчаток і дівчат - це запалення зовнішніх геніталій і піхви, придатків матки і, рідше, матки різної етіології. При цьому має місце вікова специфічність форм запальних захворювань: у період дитинства - це найчастіше вульвовагиніти, а в період статевого дозрівання - запалення придатків матки і іноді матки. 3.4.1.
  6.  Лейоміома матки
      Визначення поняття. Лейоміома матки (ЛМ) - одна з найбільш часто зустрічаються доброякісних пухлин репродуктивної системи жінки. Пухлина має мезенхімального походження і утворюється з мезенхіми статевого горбка, навколишнього зачатки Мюллерова проток (рис. 4.8). Мезенхіма є попередником примітивного міобласти, індиферентних клітин строми ендометрію і різних клітинних
  7.  Генітальний ендометріоз
      Визначення поняття. Поняття ендометріоз включає наявність ендометріоподобние розростань, що розвиваються поза межами звичайної локалізації ендометрію - на вагінальної частини шийки матки, в товщі м'язового шару матки і на її поверхні, на яєчниках, тазовій очеревині, крижово-маткових зв'язках і т.п. У зв'язку з тим що анатомічно і морфологічно ці гетеротипії не завжди ідентичні слизової
  8.  Стратегія сучасної постменопаузальному терапії
      Розглянуті в перших двох розділах цієї глави дані про фізіологію і патобіологіі основних порушень, що розвиваються в організмі жінки в постменопаузальному періоді, чітко свідчать про те, що медикаментозне (переважно, гормональне) вплив є лише одним з напрямків програми лікувально-профілактичних заходів у жінок перехідного і похилого віку. Поряд
  9.  Залізодефіцитна анемія
      Сутність залізодефіцитної анемії (ЗДА) складається в нестачі заліза в організмі (виснаження запасів заліза в органах-депо), внаслідок чого порушується синтез гемоглобіну; тому кожен еритроцит містить менше гемоглобіну, ніж у нормі. ЗДА зустрічаються найчастіше інших форм анемій, що пояснюється безліччю причин, що ведуть до дефіциту заліза в організмі. Етіологія. Виділяють основні причини
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...