Головна
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
ГоловнаМедицинаІмунологія та алергологія
« Попередня Наступна »
Реферат. Біотехнологічня підходи до отримання вакцин, діагностичних та лікувальних препаратів, 2011 - перейти до змісту підручника

Отримання моноклональних антитіл

Сьогодні для підвищення специфічності антитіл використовують моноклональні антитіла.

Відомо, що В-лімфоцити, що синтезують антитіла, не можуть тривалий час культивуватися у культурі in vitro. Розв'язання даної проблеми полягало у створенні гібридної клітини. Одержавши генетичну складову від В-клітини, ця гібридна клітина була б здатна продукувати антитіла, а отримавши здатність до поділу від клітин сумісного типу - рости в культурі. Було відомо, що В-лімфоцити іноді перероджуються і стають раковими (мієломними) клітинами, набуваючи здатності до росту в культурі, водночас зберігаючи багато властивостей В-клітин. Отже, було вирішено клітини мієломи, у першу чергу ті, що не виробляють власні антитіла, поєднати з нормальними антитілопродукуючими В-клітинами.

Перший крок у процесі одержання гібридної клітинної лінії, що продукує антитіла однієї специфічності, починається з введення мишам антигену, тобто імунізації. Після циклу імунізації, проведеного протягом кількох тижнів, перевіряють, чи відбувся у тварин розвиток імунної відповіді. Якщо відповідь розвинулася, то у тварин вилучають селезінку, промивають її, подрібнюють і легко струшують для вивільнення поодиноких клітин,серед яких знаходяться й антитілопродукуючі В-клітини. Клітини селезінки змішують з суспензією спеціальних мієломних клітин, дефектних (мутантних) за ферментом гіпоксантингуанін-фосфорибозилтрансферазою (ГТФРТ~). Таку суспензію впродовж кількох хвилин інкубують у 35 %-му розчині поліетиленгліколю, а потім переносять у середовище, що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (середовище ГАТ). Оброблення поліетиленгліколем полегшує злиття клітин, проте воно відбувається рідко і є досить випадковим. У суміші є клітини мієломи, селезінки, а також гібридні (ті, що злилися) клітини мієломи-селезінки, мієломи-мієломи, селезінки-селезінки. Однак у середовищі ГАТ ростуть тільки гібридні клітини мієломи-селезінки, усі ж інші типи клітин гинуть. Клітини селезінки і клітини селезінки-селезінки, що злилися, взагалі не ростуть у культурі in vitro, а дефектні (мутантні) мієломні клітини ГГФРТ" і клітини мієломи-мієломи, що злилися, не можуть використовувати гіпоксантин як попередник у процесі біосинтезу пуринових основ гуаніну й аденіну, без яких синтез нуклеїнових кислот неможливий.
Однак у них є інший альтернативний природний шлях синтезу пуринів - за участі дигідрофолатредуктази,тому до складу середовища і входить аміноптерин, що інгібує активність цього ферменту. Таким чином, мієломні клітини ГГФРТ - і клітини мієломи-мієломи, що злилися, не можуть синтезувати пурини в середовищі ГАТ і гинуть.

Клітини, селезінки-мієломи, що злилися, ростуть у середовищі ГАТ, оскільки клітини селезінки постачають функціональний фермент ГГФРТ, що надає гібридом! здатності до утилізації екзогенного гіпоксантину середовища, незважаючи на блокування синтезу пуринів за участю дигідрофолатредуктази аміноптерином, та за рахунок здатності клітин мієломи до активного поділу. Тимідин необхідний для усунення блокування в синтезі піримідинів, зумовленого інгібуванням дигідрофолатредуктази. На 10-14-ту добу після злиття клітин у середовищі ГАТ залишаються і ростуть лише злиті гібридоми селезінки-мієломи. Потім їх вносять у лунки пластикових планшетів і вирощують на повному культуральному середовищі без ГАТ.

Після злиття й отримання гібридоми потрібно провести ідентифікацію (скринінг) гібридних клітинних ліній, що секретують специфічні антитіла до антигену, який було використано для імунізації. Для цього зазвичай проводять скринінг культуральних середовищ, що містять антитіла, наприклад імуноферментним методом. Середовище з тих лунок, у яких є антитілосекретуючі гібридоми, відбирають і переносять у лунки іншого мікротитрувального планшету, що були попередньо вкриті шаром молекул антигену-мішені. Якщо в культуральному середовищі є антитіла (перші антитіла), що розпізнають один з епітопів даного антигену, то вони зв'язуються з антигеном і залишаються в лунках після їхнього відмивання. Потім у лунки додають другі антитіла, специфічні до мишачих (перших) антитіл. Вони будуть приєднуватися до будь-яких антитіл, зв'язаних з антигеном.

В імуноферментному аналізі, що найчастіше використовується для скринінгу, до других антитіл (антимишачих) попередньо приєднують фермент, здатний розщеплювати субстрат і перетворювати незабарвлений хромоген (це все компоненти реакційної суміші) на забарвлену сполуку. Зміна кольору в одній із лунок свідчить, що вихідне культуральне середовище містило антитіла, специфічні до даного антигену.
Якщо ж таких антитіл у середовищі не було, то другим антитілам ні з чим буде зв'язуватися і вони видаляються при другому відмиванні. Хромоген у таких лунках залишиться незабарвленим.

Середовище лунок вихідного мікротитрувального планшету, яке дає позитивну імунну відповідь(зміна кольору), може містити суміш клітин, що злилися. Для одержання лінії, яка походить від однієї клітини (клони), клітинну суспензію з таких лунок розводять культуральним середовищем і висівають в інші лунки. Після культивування отриманих клонів середовища знову тестують, визначаючи, яка з клітинних ліній (гібридом) продукує моноклональні антитіла, що розпізнають антиген-мішень. У тому випадку, коли отримують більше однієї специфічної гібридоми, проводять подальші дослідження, що дозволяють визначити, чи спрямовані антитіла, які виробляються різними клонами, проти однієї і тієї ж антигенної детермінанти. Кожен клон, що продукує моноклональні антитіла, можна підтримувати в культурі практично нескінченно. Крім того, зразки можна заморозити в рідкому азоті і використовувати їх надалі як джерело клітин.

Іноді гібридоми культивують в організмі мишей. Для цього гібридому вводять у черевну порожнину мишей сумісної генетичної лінії, попереднього пригнітивши їхню імунну систему, наприклад, вводячи мінеральне масло. Гібридома (власне злоякісна пухлина) приживається у черевній порожнині миші, починає розмножуватися і синтезувати велику кількість антитіл, які можна виділити з асцитної рідини.

Одержані за гібридомною технологієюмоноклональні антитіла мають абсолютно однакову специфічність, належать до одного класу, підкласу імуноглобулінів і є практично стандартними препаратами, характеристики яких не залежать від умов утримання тварин, їхніх індивідуальних особливостей та ін. У зв'язку з цим сьогодні моноклональні антитіла широко використовуються як компоненти діагностичних препаратів, нові типии вакцин, для виділення надчистих препаратів деяких речовин та у багатьох інших сферах, про які буде згадано нижче.
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
Інформація, релевантна "Отримання моноклональних антитіл"
  1. ВЕТЕРИНАРНА ВІРУСОЛОГІЯ, ЇЇ ДОСЯГНЕННЯ І ЗАВДАННЯ В ДІАГНОСТИЦІ І ПРОФІЛАКТИЦІ ВІРУСНИХ ХВОРОБ ТВАРИН
    Вірусні інфекції сільськогосподарських тварин становлять серйозну проблему ветеринарної медицини у зв'язку з убіквітарністю вірусів, різноманітністю шляхів їх передачі, частим виникненням їх різних асоціацій, появою нових вірусних хвороб, відсутністю специфічних та ефективних засобів специфічної профілактики при багатьох захворюваннях. Економічні збитки, спричинені вірусними інфекціями, можуть
  2. Інтерферони
    Інтерферони - родина білків, що були ідентифіковані у риб, птахів, рептилій і ссавців як антивірусні агенти широкого спектру дії. Інтерферони впливають на ріст клітин і функції імунної системи. Така дія інтерферонів на клітини зумовлена змінами у метаболізмі, що виникають після зв'язування інтерферону зі специфічним рецептором. Інтерферони досліджували головним чином як антивірусні агенти. Вони
  3. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВАКЦИН
    Інфекційні хвороби були і залишаються практично головною причиною смертності. Важливим внеском у підтримання здоров'я суспільства за останні 100 років було введення у практику санітарних норм і вакцинації, які значно знизили рівень смертності від інфекційних хвороб. Сучасна імунологія розвинулась на базі успіху E. Дженнера і Л. Пастера у вакцинації проти віспи та холери. Величезним її тріумфом є
  4. ІНТЕРФЕРОН
    Роль інтерферону. Відкриття інтерферону - це новий розділ імунології - вчення про несприйнятливість організму до інфекцій. Інтерферон - особливий противірусний білок, який продукується зараженими клітинами чи цілим організмом. Відкрили його англійські вірусологи Айзекс і Лінденман (1957). Цьому відкриттю передувало велике число робіт з вірусної інтерференції. Власне, зі спостережень за цим
  5. Фактори клітинного імунітету
    Т-клітини мають на поверхні антигенспецифічні рецептори. При стимуляції антигеном Т-клітини здійснюють три різні функції: 1) специфічно убивають чужорідні клітини чи власні клітини організму, інфіковані вірусами; 2) допомагають специфічним Т- чи В-лімфоцитам відповідати на антиген і можуть активізувати деякі інші клітини (не лімфоцити), наприклад макрофаги; 3) пригнічують (супресія) відповіді
  6. ОСОБЛИВОСТІ ЕПІЗООТОЛОГІЇ ВІРУСНИХ ІНФЕКЦІЙ
    У епізоотології вірусних хвороб є особливості, що відрізняють їх від інфекцій бактеріального характеру. Плин вірусної інфекції. Гострий плин характеризується яскравим проявом клінічних ознак хвороби (наростанням їх числа і виразністю прояву, потім - у залежності від біологічних властивостей вірусу, фізіологічного й імунобіологічного стану організму, видужання чи загибелі тварини). Приклади
  7. ІНАКТИВОВАНІ ВАКЦИНИ
    Інактивовані вакцини - складні по складу препарати. Виробництво їх вимагає великої кількості вірусу. Наприклад, у виробництві інактивованої протиящурної вакцини використовуються реактори ємністю до 2 т для вирощування клітин ВНК-21 і вірусу глибинним методом. У виготовленні інактивованих противірусних вакцин з кожним роком проблема сировини (біологічної системи, у якій репродукується вірус)
  8. СУБОДИНИЧНІ (МОЛЕКУЛЯРНІ) ВАКЦИНИ
    Відомі три методи створення субодиничних вакцин. Перший складається в одержанні великої кількості вірусу, його очищенню і виділенні імуногенних субодиниць ("спліт-вакцини"), однак цей спосіб досить дорогий і навряд чи знайде коли-небудь, промислове застосування. Другий метод - хімічний синтез специфічного імуногену, що вимагає знання структури й амінокислотного складу антигенних детермінант.
  9. ПРОТИВІРУСНІ ВАКЦИНИ
    Виготовлення, контроль та застосування. 1) Класифікація і типи вакцинних препаратів. 2) Інактивовані вакцини. 3) Живі вакцини. 4) Гетерологічні вакцини. 5) Субодиничні вакцини. 6) Реасортантні вакцини. 7) Рекомбінантні живі вакцини. 8) Рекомбінантні субодиничні вакцини. 9) Синтетичні вакцини. 1. Класифікація і типи вакцинних препаратів.
  10. 7.1. КРАПИВНИЦА
    Крапивница - общее название группы заболеваний, основным клиническим симптомом которых служат преходящие эритематозные зудящие волдырные элементы размером от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров, четко отграниченные и возвышающиеся над поверхностью кожи. Классификаций По продолжительности: - Острая крапивница длится менее 6 недель - Хроническая крапивница
© medbib.in.ua - Медична Бібліотека