загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові , генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Визначення в продуктах тваринництва мікроскопічних грибів та їх метаболітів - мікотоксинів

Мета заняття: Ознайомитися з поширенням мікотоксинів та їх дією на організми, вивчити методи дослідження мікроскопічних грибків і залишкових кількостей мікотоксинів у продуктах тваринництва



Завдання:

1. Вивчити поширення і небезпека впливу мікотоксинів на живий організм

2. Ознайомитися з Мікологічне і мікотоксикологічних методами досліджень

3. Провести посів досліджуваних зразків продуктів в спеціалізовані середовища для виявлення мікроскопічних грибків

4. Визначити концентрацію мікотоксинів у досліджуваних продуктах



Об'єкти дослідження. Проби м'яса, молока, сиру, оре-хів.

Обладнання та реактиви. Агар Чапека, Сабуро; чашки Петрі; пробірки; спиртівка; ножиці; пінцет, пастерівські піпетки; препарувальні голки; предметні скла; штам грибка Aspergillus flavus; мікроскоп; набір ТШХ; стандарти мікотоксинів; термостат; білі миші, щури, кролики, кури, каченята ; рибки Гуппі; хлороформ; оцтовий ангідрит; сірчана, соляна кислоти.



Коротка характеристика мікроскопічних грибів

та їх метаболітів

З природних екотоксінов - забруднювачів сільськогосподарської сировини та продуктів харчування найбільшу небезпеку для здоров'я населення і тварин представляють мікроскопічні гриби і їх токсини.

Гриби - це хемоорганотрофние мікроорганізми з еукаріотичної клітинної організацією, позбавлені фотосинтетичних пігментів. Гриби відносять до класу Fungi (лат.) або Mycota (грец.), що включає в себе близько 120 000 видів. Вони мають ряд властивостей притаманних тваринним і рослинним організмам. Гриби належать до еукаріотів, позбавлені хлорофілу і мають включення хітину в клітинній оболонці.

Одними з найбільш сприятливих субстратів для розвитку раз-особистих видів мікроскопічних грибів, є корми рослинного походження. Гриби в процесі своєї життєдіяльності виділяють різні метаболіти - мікотоксини, які разом з кормом потрапляючи в організм тварини, знижують його резистентність, сприяють розвитку інфекційних і незаразних хвороб, знижують продуктивні якості тварин, у великих кількостях викликають серйозні пошкодження організму аж до загибелі. Мікотоксини складають групу хімічних сполук, що відрізняються високою токсичністю, мутагенні, тератогенні, канцерогенними і імуносупресивними властивостями.

В даний час відомо більше 250 видів мікроскопічних грибів, які продукують за різними даними близько 400 мікотоксинів і воно, ймовірно, буде зростати за рахунок встановлення етіології но-вих мікотоксикозів. Найбільшу небезпеку становлять токсини грибів роду Aspergillus, Fusarium, Penicillium. До числа найбільш небезпечних мікотоксинів відносять: афлатоксини, охратоксини, зеараленон, тріхотеценовие мікотоксини, цитринін, патулін, треморгенние мікотоксини, ерготоксин. Всі вони відрізняються високою стабільністю і зберігають свою біологічну активність у контамінованих субстраті протягом тривалого часу.

Афлатоксини - одні з найсильніших канцерогенів біологічного походження з яскраво вираженою гепатотропних. В силу особливої ??біологічної активності і широкої поширеності особливу небезпеку становить афлатоксин В1.

Афлатоксини мають здатність сильно флюоресціровать при впливі довгохвильового ультрафіолетового випромінювання, що лежить в основі практично всіх фізико-хімічних методів їх обготівковув-ружения та кількісного визначення. Слід звернути увагу на те, що афлатоксини практично не руйнуються в процесі звичайної технологічної та кулінарної обробки забруднених харчових продуктів.

Головним послеубойную діагностичною ознакою афлатоксікоза зазвичай є ураження печінки, що розвиваються в різному ступені і характеризується інфільтрацією, дегенерацією, каріолізисом і проліферацією мезенхіми. Проліферація часто призводить до утворення пухлини на поверхні печінки. Зміни типу карциноми і саркоми в подальшому можуть переходити в рак. Токсини аспергиллов пов'язують ДНК і, таким чином, гальмують утворення РНК і білка, тому деякі автори почали вивчати його дію на імунітет і резистентність. З цього часу встановлено, що токсини, навіть у са-мій низької концентрації, додані в корм птиці, знижують різі-стентності останніх до інфекцій.

Канцерогенна активність афлатоксинов відрізняється від дії інших гепатоканцерогенних речовин деякими особливостями: можливістю розвитку пухлинного процесу не тільки при тривалому впливі малих доз токсину, а й при одноразовому введенні великої дози; розвитком пухлини печінки часто без попереднього цирозу; розвитком на тлі тривало зберігається биллиарной проліферації гепатоцеллюлярного раку, а не аденокарцином.

Мутагенна дія афлатоксинов вивчено на різних організмах і типах рослинних і тваринних клітин. Як афлатоксин В1, так і суміш афлатоксинов індукують хромосомні аберації (головним чином хроматидні розриви і транслокації) в рослинних клітинах, культурі клітин лейкоцитів людини, клітин нирки кенгурові щури та китайського хом'ячка, в клітинах кісткового мозку мишей, хом'ячків і мавп.

Дані про тератогенні властивості афлатоксинов нечисленні. В експериментах тератогенну дію афлатоксину В1 було продемон-стрировать на хом'яках, щурах, мишах і на курчатах.
трусы женские хлопок


Результати вивчення впливу афлатоксинов на імунну відповідь у різних тварин і птахів показали, що вони є сильними імунодепресантами і пригнічують як клітинний і гуморальний імунітет, так і чинники неспецифічного захисту організму. Результатом зниження функціональної активності імунної системи тварин під дією афлатоксинов є зменшення їх резистентності до інфекційних захворювань. Максимально допустима концентрація афлатоксинов в харчових продуктах - 0,005 мг / кг (Е.М. Кожевников, Б.С. Майканом).



Методи виділення грибів

Як твердих поживних середовищ найбільш широко застосовують-ються сусло-агар, агар Чапека, картопляний агар з додаванням різних антибіотиків для придушення зростання бактерій.

Культивування проводять у термостаті при температурі 24-26 і 37 ° С протягом 3-12 днів залежно від виду розвиваються гри-бов.

При виділенні грибів з ураженого матеріалу користуються різними методиками, в залежності від того, яку переслідують мету: виділення поверхневої мікофлори або глибинної. З метою визначення загальної мікобіоти зазвичай користуються наступною методикою: окремі зерна або дрібно нарізані шматочки досліджуваних зразків без попередньої обробки розкладають на поверхні живильного середовища і спостерігають за ростом колоній грибів.

При виявленні поверхневої мікофлори роблять змив стерильність-ної водою і висівають на живильні середовища. Для змиву більшого ко-личества суперечка проби рекомендується добре струшувати.

Складнішою є методика виділення глибинної мікофло-ри, при якій обов'язкова попередня дезінфекція проби з метою придушення грибів, що знаходяться на поверхні досліджуваного матеріалу.



Визначення концентрації афлатоксинов в продуктах тваринництва методом тонкошарової хроматографії

Визначення концентрації афлатоксинов в кормі, молоці, внут-рішніх органах і м'язової тканини проводять методом двовимірної тонкошарової хроматографії з застосуванням пластинок «Силуфол» згідно «Методичних рекомендацій з виявлення, ідентифікації та визначення змісту афлатоксинов в харчових продуктах».

Метод заснований на екстракції токсинів з кормів водним ацетоном (ГОСТ 2603-71 Ацетон) при шуттелірованіі, очищенню первісного екстракту від супутніх домішок гексаном (ТУ 6-09-3375-73) з подальшою переекстракціей токсинів в хлороформ (ГОСТ 3160-51 Хлороформ медичний) або бензол (ГОСТ 5955-75 Бензол) і очищенням на хроматографічної колонці з силікагелем і окисом алюмінію. Ідентифікація та кількісне визначення грунтується на методі хроматографії екстракту в тонкому шарі з використанням пластинок «Силуфол», з подальшим переглядом в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 365 н. і в порівнянні зі стандартом афлатоксинов.



Контроль токсичності досліджуваного матеріалу

Дослідження проб на наявність мікотоксинів здійснюють з по-міццю різних методів, які можна поділити на три ос-новні групи: біологічні, хімічні та фізико -хімічні.

Біологічні методи. За допомогою цього методу проводять біо-пробу на тварин, у яких було зафіксовано токсикоз. При здійсненням цієї роботи важливе значення мають раціон годівлі та проби корму, що відбираються для досвіду.

Визначення токсичності кормів на лабораторних живіт-них. Для цих цілей використовують білих мишей, щурів, морських свинок, кроликів, курчат, каченят, голубів, цуценят, кошенят та ін Добову норму звичайних кормів замінюють досліджуваним кормом. Для його кращою поедаемости доцільно тварин попередньо витримати на голодній дієті. Під час досвіду водопій не обмежують. Щодня реєструють кількість з'їденого корму і стан піддослідних тварин. Залежно від ступеня токсичності корму прояв клінічних ознак Мікотоксикози настає в різні терміни. Характерні клінічні ознаки: пригнічення тремтіння, парези, паралічі, втрата блиску шерсті. Корми уражені токсигенними грибами, викликають загибель тварин у терміни від 1 до 30 днів з ознаками ураження центральної нервової системи. У птахів відзначають ціаноз гребеня і сережок, пронос, сонливість.

Крім згодовування досліджуваних проб тваринам, можна вводити їх безпосередньо в шлунок.

Введення в шлунок. З досліджуваної навішування готують водну бовтанку і вводять мишам натщесерце в шлунок протягом 3 днів в кількості 0,5 мл. Як зонд може служити надіта на шприц, тупа, злегка зігнута голка. Токсичність корму визначають за часом загибелі мишей та кількістю введеної витяжки або екстракту. Для дослідження кормів, уражених грибом A. flavus, екстракт з зразка вводять в залозистий шлунок одноденних каченят: в 1-й день - 0,5 мл, у 2-й - 0,75, в 3-й - 1,25, в 4-й день - 1,5 мл. Спостереження за каченятами ведуть протягом 7 днів, потім їх вбивають і досліджують печінку. Наявність жирової дистрофії, розвиток проліферативних процесів в жовчних протоках, множинні геморагії свідчать про наявність у досліджуваних кормах афлатоксинов.

Постановка шкірної проби на кролику. Ця методика є найбільш поширеною зважаючи порівняльної її нескладності. Шкірна проба дає можливість не тільки відповісти на питання про ток-січності корму, але і за характером ураження шкіри скласти перед-уявлення про ступеня токсичності грибів.

Як піддослідних тварин використовують кролів з непіг-ментіровать шкірою, живою масою 2-3 кг, хорошою вгодованості.
У тварин обережно, не допускаючи скарификации і травматизації, вистригають на боці шерсть. На ділянку оголеної шкіри діаметром 3 см дворазово з інтервалом у 24 год наносять отриманий екстракт, втираючи його скляною паличкою у всю вистріженную поверхню шкіри. Для попередження злизування екстракту, який викликає подразнення шкіри, на шию кролика надягають дерев'яний комір. Облік реакції проводять щодня протягом 3-7 днів. Ступінь токсичності диференціюють за глибиною і характером запальної реакції:

I ступінь - почервоніння, підвищена чутливість шкіри, ше-лушения;

II ступінь - почервоніння, болючість, незначне потовщені -ня шкіри, дрібні поодинокі з просяне зерно або менше жовтуваті бульбашки, лущення;

III ступінь - почервоніння, сильне потовщення, болючість, складчастість шкіри, на всій поверхні жовті вогнища, поверхневий некроз, іноді виразки, суцільний струп;

IV ступінь - почервоніння, сильний набряк, виступаючим у вигляді масивного валу на нижній межі; некроз, захоплюючий підшкірну клітковину, нерідко освіту довго не гояться виразок. Струп товстий і суцільний.

Очна проба. Подрібнений корм заливають водою у співвідношенні 1:10. Після 24-годинного екстрагування фільтрують через марлю, а потім через паперовий фільтр. Контролем служить водний екстракт. Піддослідному кролику в кон'юнктивальний мішок одного ока вводять по 5 крапель досліджуваної витяжки з інтервалом 5 хв протягом 1 ч. У другій очей ін'єктують контрольний екстракт. Через 1 год після введення токсичного екстракту відзначають розширення зіниці на 3-4 мм, яке зберігається протягом 5-б ч. Контрольна витяжка викликає короткочасне розширення зіниці на 1-2 мм. Методика застосовується для визначення токсичності грибів роду Fusarium і мікроміцетів Ph. chartarum. Введення спорідесміна викликає ураження рогівки і косоокість.

Проба на борідках курей. Подрібнений корм заливають ефіром або спирт-ефіром і екстрагують протягом 24 год, потім фільтрують і випаровують розчинник.

Ефірні екстракти вводять в одну з борідок курки в дозі 0,1-0,2 мл, друга борідка служить контролем. Ступінь токсичності визначають наявністю запального процесу - набряку борідки. Товщина борідки може досягати 5-8 мм. У контрольної птиці товщина борідки не перевищує 4 мм. Реакція найбільш виражена через 20-24 год після введення екстрактів.

  Токсико-біологічну оцінку досліджуваних проб проводять на акваріумних рибок гуппі згідно з методикою «Біологічна оцінка токсичності продуктів». Принцип методики заснований на витяганні з аналізованих проб молока фракції афлатоксинов ацетоном з очищенням від жирових речовин гексаном і переекстракціей в хлороформ. Висушені насухо екстракти проб молока розчинили окремо в 5 мл ацетону і перенесли в хімічні склянки ємністю 1000 мл з 500 мл акваріумний води з кімнатною температурою (20 ° С). У кожен хімічний стакан поміщають по 5 дорослих гуппі, за якими ведуть спостереження, відзначаючи загибель через 24 години. Оцінку токсичності проб молока встановлювали за схемою, відображеної в таблиці 2.



  Таблиця 2 - Оцінка ступеня токсичності





  Крім перерахованих вище біологічних методів ставлять пробу на еритроцитах щурів, на серце жаби, на простих і на яйцях молюсків.

  Мікробіологічні методи. Мікробіологічні методи об-наруженія мікотоксинів засновані на принципі інгібування росту бактеріальних і дріжджових тест-культур під дією випробовуваних екстрактів. Для кожного мікотоксину підібрані чутливі мікроорганізми. Для фузаріотоксінов, Т-2-токсину, зеараленону використовують культуру дріжджів Saccharomyces fragilis, для фумігатоксінов - Staphylococcus aureus, для дендродохіотоксінов - добову культуру Saccharomyces vini, для патуліну - Bacillus subtilis. З метою проведення досліджень застосовують такі методи: Метод паперових диско, метод циліндрів і метод лунок.

  Хімічні методи. Методи засновані на властивості токсинів грибів, що містяться в ефірних екстрактах, при з'єднанні з хімічними речовинами змінювати їх колір.

  Реакція Лібермана-Бурхарда. Екстракт кормів або грибів стахіботріотоксикозу і фузаріотоксикоз в кількості 2-3 мл випарюють в осад і знову розчиняють у хлороформі. До розчину додають декілька крапель оцтового ангідриду. На отриманий розчин обережно по стінці нашаровують концентровану сірчану кислоту. При наявності токсичних речовин на межі розділу рідин з'являється кільце зеленого кольору, яке потім стає фіолетовим, а пізніше бурим.

  Реакція з концентрованою соляною кислотою. До 1 мл екстракту додають 0,5 мл концентрованої соляної кислоти. При наявності токсичних речовин грибів роду Fusarium розчин забарвлюється в червоний або вишневий колір.

  Реакція з концентрованим розчином аміаку. До 1 мл екс-тракту токсину в сірчаному ефірі додають 5-7 мл 96% етанолу, обережно підігрівають і додають 5-7 мл 25% водного розчину аміаку. При кип'ятінні протягом 5-10 хв за наявності мікотоксинів з'являється інтенсивна чорно-фіолетове забарвлення, потім випадає осад чорного кольору. 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Визначення в продуктах тваринництва мікроскопічних грибів та їх метаболітів - мікотоксинів "
  1. А
      список А, група отруйних високо токсичних лікарських засобів, що передбачається Державною фармакопеєю СРСР; доповнюється і змінюється наказами Міністерства охорони здоров'я СРСР. При поводженні з цими лікарськими засобами необхідно дотримуватися особливої ??обережності. Медикаменти списку зберігаються в аптеках під замком в окремих шафах з написом «А - venena» (отруйні). Перед закриттям
  2. Г
      + + + Габітус (лат. habitus - зовнішність, зовнішність), зовнішній вигляд тварини в момент дослідження. Визначається сукупністю зовнішніх ознак, що характеризують статура, вгодованість, положення тіла, темперамент і конституцію. Розрізняють статура (будова кістяка і ступінь розвитку мускулатури): сильне, середнє, слабке. Вгодованість може бути гарною, задовільною,
  3. П
      + + + Падевий токсикоз бджіл незаразна хвороба, що виникає при харчуванні бджіл (падевим медом і супроводжується загибеллю дорослих бджіл, личинок, а в зимовий час і бджолиних сімей. Токсичність падевого меду залежить від наявності в ньому неперетравних вуглеводів, алкалоїдів, глікозидів, сапонінів, дубильних речовин, мінеральних солей і токсинів, що виділяються бактеріями і грибами. Потрапляючи в середню
  4. Т
      + + + Таблетки (Tabulettae), тверді дозовані Лікарське форми, одержувані пресуванням. Мають вигляд круглих, овальних чи іншої форми пластинок або дисків. До складу Т. входять Лікарське та допоміжні речовини. В якості останніх (їх кількість не повинна перевищувати 20% від маси ліків, речовин) застосовують цукор, крохмаль, глюкозу, гідрокарбонат натрію, хлорид натрію, каолін, тальк і
  5. Ф
      + + + Фавус (Favus) тварин, парша, «білий гребінь», інфекційна хвороба птахів, рідше ссавців, що характеризується ураженням шкіри, пір'я, волосся, кігтів, внутрішніх органів. У СРСР зустрічається рідко. Збудники Ф. - недосконалі гриби роду Achorion. Ф. птахів викликається грибом A. gallinae (Trichophyton gallinae). A. quinckeanum (T. quinckeanum) - збудник Ф. мишоподібних гризунів,
  6. Д
      + + + Давенеідози (Davaineidoses), гельмінтози птахів, що викликаються цестодами сімейства давенеід. Серед них мають значення давенеози і райетіноеи. + + + Давенеоз (Davaineosis), гельмінтоз птахів, що викликається цестодами роду Davainea сімейства Davaineidae, що паразитують у кишечнику. Поширений повсюдно. Найбільший економічний збиток птахівництву заподіює Д. курей. Збудник Д. курей - D.
  7. К
      + + + Каверна (від лат. Caverna - печера, порожнина), порожнина, що утворюється в органах після видалення некротичної маси. К. виникають (наприклад, при туберкульозі) в легенях. К. можуть бути закритими і відкритими при повідомленні їх з природним каналом. Див також Некроз. + + + Кавіози (Khawioses), гельмінтози прісноводних риб, що викликаються цестодами роду Khawia сімейства Garyophyllaeidae,
  8. М
      + + + Магнезія біла, те ж, що магнію карбонат основний. + + + Магнезія палена, те ж, що магнію окис. магнію карбонат основний (Magnesii subcarbonas; ФГ), магнезія біла, в'яжучий і антацидний засіб. Білий легкий порошок без запаху. Практично не розчиняється у воді, що не містить вуглекислоти, розчинний у розведених мінеральних кислотах. Застосовують зовнішньо як присипку, всередину -
  9. О
      + + + Обволікаючі засоби, см. Слизові кошти. + + + Знешкодження м'яса, см. Умовно придатне м'ясо. + + + Знезараження води, звільнення води від мікроорганізмів, патогенних для тварин і людини. Методи О. в.: Хлорування, кип'ятіння, озонування, знезараження ультрафіолетовими променями, ультразвуком, струмами високої частоти і ін Найчастіше застосовують хлорування води, використовуючи
  10. С
      + + + Сабур (тур. sabur), висушений сік листя рослини алое (Aloe arborescens) сімейства лілійних; проносний засіб. Темно-бурі шматки або порошок. Добре розчинний у гарячій воді, спирті, розчинах лугів. Діючі початку - антрагликозиди (алоин). У малих дозах діє як гіркота, покращуючи апетит і посилюючи травлення, желчегонно. Місцево чинить слабку подразнюючу,
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...