Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
ГоловнаМедицинаОнкологія
« Попередня Наступна »
Петренко А.А. Аналіз метилування ДНК при раку шийки матки, 2003 - перейти до змісту підручника

Методи ідентифікації CpG-острівців, аберантно-метильованих в пухлинах

MCA (methylated CpG island amplification) - метод, що дозволяє вибірково ампліфікувати CpG-острівці, диференційно метиловані в нормальних і пухлинних клітинах, а потім клонувати і секвенувати їх (Toyota et al. 1999). ДНК спочатку обробляють рестриктазою Smal (сайт впізнавання СССGGG не розщеплюється, якщо він містить 5-метілцітозін), яка дає фрагменти з "тупими" кінцями. Метиловані сайти СССGGG потім розщеплюють нечутливою до метилированию рестриктазою Хит!, Яка формує фрагменти з "липкими" кінцями. Саме останні можуть взаємодіяти з адаптерами і бути в подальшому ампліфіцірованни. У поєднанні з методом репрезентативного диференціального аналізу (RDA) (Lisitsyn et al. 1993) цей підхід дозволяє вибірково ампліфікувати CpG-острівці, аберантно метиловані в пухлинних клітинах. Таким способом в клітинах раку товстого кишечника були ідентифіковані і клоновані 33 послідовності, включаючи фрагменти відомих генів (PAX6, Versican, a-tubulin, CSX, OPT та ін.)

RLGS (restriction landmark genomic scanning) дозволяє одночасно аналізувати статус метилювання в геномі декількох тисяч CpG-острівців (Eng et al. 2000; Costello et al. 2000) . Суть методу полягає у поділі двомірним електрофорезом рестрикційних фрагментів, отриманих обробкою геномної ДНК кількома рестриктазами. Спочатку ДНК обробляють крупнощепящей рестриктазою NotI, сайти якої переважно розташовуються в CpG-острівцях і яка розщеплює тільки неметілірованние сайти. Потім отримані фрагменти мітять по кінцях радіоактивною міткою, рестріціруют другий ферментом (наприклад, EcoRV) для зменшення їх розмірів і продукти гідролізу поділяють в першому напрямку (у капілярної трубці з агарозном гелем). Розділені фрагменти Notl / EcoRV обробляють in situ (тобто в гелі) ще однієї рестриктазою (наприклад, HinfI) для більшої фрагментації ДНК, після чого проводять електрофорез в поліакриламідному гелі в другому напрямку. Пластину гелю авторадіографіруют і в результаті виявляють безліч плям, положення яких строго визначено. За їх інтенсивності судять про ступінь метилування відповідного CpG-острівця. Інтенсивність плями, прийнята за нормальну, свідчить про неметілірованном статусі обох алелей, наполовину знижена - про метилировании одного з алелів, зникнення плями - про метилировании обох алелей (відповідний сайт не розщеплюється NotI).
Саме цим методом було продемонстровано широке поширення аберрантного метилювання CpG-острівців у багатьох типах пухлин.

СП-ПЛР (метілчувствітельная ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами) використовується для пошуку CpG-острівців, абберантних-метильованих в пухлинах (Gonzalgo et al. 1997; Liang et al. 1998). Перевагою методу є можливість виявлення раніше невідомих CpG-острівців. Метод заснований на використанні статистичних праймерів з GC-багатим 3 'кінцем, амплифицируют в неспецифічних умовах GC-багаті ділянки геному, включаючи і CpG-острівці. Різниця у статусі метилування фрагментів виявляють за допомогою попередньої ампліфікації обробки ДНК метілчувствітельнимі рестриктазами. При використанні різних варіантів праймерів цей метод дозволяє вести широкий скринінг диференційно метильованих в нормальній і пухлинної тканинах GC-багатих послідовностей (докладніше про принцип методу см. в розділі "Результати").
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
Інформація, релевантна " Методи ідентифікації CpG-острівців, аберантно-метильованих в пухлинах "
  1. Петренко А.А. Аналіз метилування ДНК при раку шийки матки, 2003
    Введення метилювання ДНК Поширення метилювання ДНК Функція метилювання ДНК Метилирование під час розвитку Ферменти метилування Метилирование як динамічний процес Роль метилювання в канцерогенезі Генетична роль метилювання ДНК в канцерогенезі Епігенетична роль метилування ДНК в канцерогенезі Порівняльний аналіз сучасних методів визначення статусу
  2. Введення
    Актуальність теми: Рак шийки матки посідає друге місце серед усіх онкологічних захворювань у жінок. Етіологічним фактором раку шийки матки (РШМ) визнані віруси папілом людини (HPV) з так званої групи високого ризику (типи 16, 18 та інші). Після вірусної інфекції РШМ може розвинутися через стадії дисплазії, раку in situ впродовж декількох років, протягом яких у прогресію
  3. Порівняльний аналіз сучасних методів визначення статусу метилювання ДНК
    Незважаючи на відсутність розуміння механізмів порушення метилювання ДНК в канцерогенезі, відмінність патернів метилування нормальної та пухлинної клітин широко використовуються для оцінки широти поширення аберрантного метилування в пухлинах, для виявлення генів, втрата функцій яких вносить вклад в розвиток пухлин, і для пошуку діагностичних маркерів пухлин різних типів. Методи
  4. Дослідження експресії і статусу метилювання гена Р3А-адаптіна при раку шийки матки
    Після встановлення повного розміру CpG-острівця гена вза-адаптіна ми провели дослідження взаємозв'язку між метилированием цього CpG-острівця і транскрипцією асоційованого з ним гена. Як відомо, метилирование CpG-острівця зазвичай супроводжується інактивацією транскрипції (див. розділ "Метилирование ДНК"). Тому завданнями нашого дослідження на даному етапі були вивчення рівня експресії
  5. Запальні захворювання зовнішніх статевих органів у дівчаток і дівчат
    Визначення поняття. Запальні захворювання геніталій у дівчаток і дівчат - це запалення зовнішніх геніталій і піхви, придатків матки і, рідше, матки різної етіології. При цьому має місце вікова специфічність форм запальних захворювань: у період дитинства - це найчастіше вульвовагиніти, а в період статевого дозрівання - запалення придатків матки і іноді матки. 3.4.1.
  6. . ІНФЕКЦІЇ, ВИКЛИКАЮТЬСЯ Гемофилюс. КОКЛЮШ
    Ральф Д. Фейгін, Фредерік M. Мерфі (Ralph D. Feigin, Frederick M. Murphy) Паличка інфлюенци (Haemophilus influenzae) була виділена Пфейффером в 1892 р. з мокротиння людей, які захворіли під час пандемії грипу. Назва її пов'язана з тим, що для її зростання in Vitro потрібно додавання крові в живильне середовище, а також з тим, що її підозрювали в якості причини проходила тоді пандемії. С
  7. ЕНДОКРИННІ ПРОЯВИ ПУХЛИННИХ ХВОРОБ
    Лоренс А. Фроум (Lawrence A. Frohman) Про секреції гормонів пухлинами, що походять з неендокрінних тканин, відомо протягом більше 50 років. Спочатку в більшості випадків це пов'язували з явищами гіпоглікемії і гіперкальціємії, проте термін «ектопічна секреція гормонів» вперше був використаний у зв'язку з синдромом Кушинга, обумовленим секрецією адренокортикотропного
  8. ліподистрофією ТА ІНША, рідкісним патологіям жирової тканини
    Даніел У. Фостер (Daniel W. Foster) Справжня глава присвячена патології жирової тканини. Вона зустрічається рідко, патофізіологія її часто неясна, і в даний час можна привести лише її клінічну характеристику. Ліподистрофії ліподистрофією характеризуються генералізованим або частковим зникненням жиру і метаболічними порушеннями, в тому числі
  9. ОБМІН кальцію, фосфору і кісткової тканини: кальційрегулюючих ГОРМОНИ
    Майкл Ф. Холік, Стефеп М . Крепі, Джої Т. Поттс, молодший (Michael F. Holick, Stephen M. Krone, John T. Potts, Jr.) Структура і метаболізм кісткової тканини (див. гл. 337) Кость - це динамічна тканину, постійно перебудовувалася впродовж життя людини. Кістки скелета добре васкулярізована і отримують приблизно 10% хвилинного об'єму крові. Будова щільною і губчастої кісток
© medbib.in.ua - Медична Бібліотека