загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Культивування вірусів грипу людини в лабораторних умовах, коло господарів серед лабораторних тварин і виділення вірусу з клінічного матеріалу

В. Р. Даудл і Г. С. ШИЛД (WR DOWDLE, G. С. SCHILD)



I. ВСТУП

Вперше пасаж вірусу грипу в експерименті був здійснений на початку століття при роботі з ВЧП, проте до 1955 р. він не'бил віднесений до вірусів грипу (Schafer, 1955). У 1931 р. Shope пасеровані «. Класичний» грип на свинях шляхом інтраназального введення їм фільтрату виділень з респіраторних шляхів. Перші дані про зараження лабораторних тварин вірусом грипу людини були отримані Smith і співавт. (1933). Автори показали, що у тхорів, заражених виділеннями з респіраторних шляхів людини, хворих на грип, розвивалася респіраторна інфекція, що супроводжувалася лихоманкою і поширювана серед них природним шляхом. Ці результати незабаром підтвердив Francis (1934). Потім було показано, що у мишей, 'яким йод наркозом вводили матеріал, взятий з носових раковин хворих тхорів, розвивалася пневмонія (Andrewes et al., 1934). Ці дослідження привели до використання лабораторних тварин для визначення інфекційності вірусу і забезпечили швидке накопичення знань про властивості вірусів грипу та імунітету, до цієї інфекції.

Burnet (1940) виявив, що вірус 'грипу може розмножуватися в «льотках, що вистилають аллантоісную і амніо-тичні порожнини курячого ембріона, що виявилося важливим для вивчення вірусів грипу. З'явилася можливість уникнути незручностей, пов'язаних з роботою на лабораторних тварин, а також можливість у великих кількостях отримати вірус грипу у вигляді аллантоісной рідини заражених ембріонів. Крім того, стало 'можливим виділяти вірус грипу безпосередньо «а ембріонах, без попередньої адаптації його до тхорам або мишам, яка могла призвести до випадкового забруднення вірусу сторонніми агентами. Відкриття гемагглютинирующих властивостей вірусних частинок (Hirst, 1941) також мало велике значення, оскільки забезпечило можливість виявляти вірус без необхідності демонструвати його інфекційні властивості. Наступним кроком, 'що мали очевидне значення для вивчення реплікації вірусу грипу, було культивування вірусу в культурах клітин (Mogabgab et al., 1954). Розробка систем бляшок в одношарових клітинних культурах для визначення інфекційне ™ вірусу в кінцевому рахунку забезпечила можливість отримання чистих клонів вірусу грипу для експериментів з генетики.

II. КУЛЬТИВУВАННЯ ВІРУСАМИ ЛАБОРАТОРНИХ УМОВАХ

А. КУЛЬТУРИ КЛІТИН

Введення вірусів грипу А або В в (Культуру клітин викликає один з трьох ефектів: 1) вірус розмножується з різною ефективністю , утворюючи інфекційне потомство (продуктивна інфекція); 2) вірус проходить неповний цикл репродукції з утворенням неповного (вірусу на поверхні клітин або неінфекційних вірусних частинок в середовищі (абортивна інфекція); 3) вірусу не вдається інфікувати Кленк. Деякі експериментальні дані (дозволяють вважати, що. Можна встановити стан хронічної інфекції, при (якому невеликі кількості інфекційного вірусу виділяються в середовище протягом тривалого часу (іереістентная інфекція).

1. Продуктивна інфекція

реплікативного цикл вірусів грипу детально описаний

в гол. 8. За введенням вірусу <в 'культуру чутливих кле

ток слід період «затемнення» ^ тривалістю прибли

зительно 2 год, протягом якого не виявляється яких-

або 'біологічних чи серологічних проявів синтезу

вірусних білків . Протягом цього періоду йде синтез вірус-

специфічних яоліпептідов,: у тому числі вірусслеціфіче-

окіх 'компонентів, що не инкорпорируются в вирион.

Приблизно через 2 год після зараження в клітинах можна

виявити антиген нуклешротеіда (NP). Кількість цього

компонента досягає максимуму до 5-6-му годині після зара

жения. Присутність гемаглютиніну або поверхневих ан

антигеном в екстрактах клітин виявляється через 3 год після

зараження. нирку вірус може бути виявлений на

оболонках клітин через приблизно 5 '/ г год після зара

жения. Незабаром після цього, приблизно через 6 год після зара

жения, починається вихід вірусу в середу, і інфекційний

вірус 'досягає максимальної. концентрації в середовищі через

7-8 год після зараження

При зараженні (вірусом грипу людини різних первинних (культур клітин, отриманих з тканин птахів або ссавців, в них (відбувається продуктивний цикл. Перелік, цих культур можна знайти у Hoyle (1968). Для того щоб не повторювати цей перелік, ми постараємося підсумувати, найбільш суттєві ^ досягнення, отримані рядом дослідників «а протягом більше 20 років експериментальної; роботи.

Епітеліоподібні клітини є найбільш чутливою, системою для культивування in vitro обширного ряду штамів вірусу грипу А і В. Частіше за інших використовують для цих, цілей нирки плоду людини (Mogabgab et al., 1954), макак резусів або зелених мавп (Mogabgab et al., 1961), нирки телят (Haas, Wulff, 1957; Lehmann-Grube, 1965 ), свиней. (Lehmann-Grube, 1964), а також хом'яків (Heath, Tyrrell,. 1959) '. З них частіше використовують первинні клітини нирок, мавп, людини і телят. Зазвичай воліють нирки мавп, що обумовлено швидкістю «х зростання і зручністю в. зверненні.

Не всі культури елітеліоідних клітин пермісивними для вірусу (гріппа. Первинні диплоїдні і гетероплоідние клітини людського амниона, так само як і інші (гетероплоідние епітеліальні клітини, зазвичай нечутливі до нього. До гетероплоідним клітинам відносяться такі лінії, ясак HeLa, KB, клітини кон'юнктиви (Green et al., 1957), а також MAF і клітини серця і кишечника людини (Wong, Kilbour-ne, 1961).

Культури епітеліощдних клітин, отримані з органів,, володіють більш однорідною чутливістю до вірусів грипу, ніж культури, отримані з органів ембріона. За нашими даними, культури клітин, приготовані з нирок, мертвонароджених (Немовлят, настільки ж чутливі до вірусів грипу, як культура клітин нирок мавп, а культури клітин ембріональних нирок людини менш чутливі. Істотною проблемою при використанні ембріональних нирок людини є різниця в чутливості між різними партіями клітин. Нирки зазвичай отримують від ембріонів різного віку, умови їх отримання теж варіюють, в результаті чого сильно (коливається відсоток життєздатних клітин. Ці фактори призводять до великої різноманітності в співвідношенні між епітеліоїдними і фиб - робластоіодобнимі клітинами в культурах нирки ембріона, людини. Це в свою чергу може призвести до значних варіацій в чутливості до вірусів. Епітеліоподібні клітини на відміну від фібробластоідних підтримують реплікацію вірусу. Аналогічні дані відлучені щодо клітин нирок свиней. Культури, отримані з нирок дорослих свиней, складаються в основному з епітеліоїдних «вічко, які підтримують реплікацію вірусу грипу. Культури, отримані з ембріональних нирок, майже повністю представлені фіброблаетамі і практично нечутливі до вірусу (Lehmann-Grube , 1964). Ця закономірність має місце у багатьох видів.

Чутливість епітеліоїдних клітин до грипозної інфекції знижується при субкультівірованія. У деяких випадках, наприклад при використанні «льоток нирки ембріона людини, субпаосаж сприяє проліферації фібро-бластів , нечутливих до вірусу. В інших випадках, наприклад при використанні нирок мавп (Dowdle, неопубліковані дані) і теляти (Lehmann-Grube, 1964), культури клітин зберігають свої епітеліоїдні властивості при численних пасажах, але спектр їх чутливості до вірусів змінюється вже при першому субкультівірованія. Ді-плоїдність епітеліоїдних (клітин сама по собі ще не визначає чутливість до вірусів.

Деякі віруси можуть розмножуватися або купувати здатність до розмноження після адаптації в фіброблаетах або в гетероплоідних лініях клітин, але таких штамів мало . Штам NWS вірусу грипу A (iHONl) унікальний за широтою клітинного спектра; він може розмножуватися в гетероплоідних епітеліальних клітинах (Wong, Kilbourne, 1961), в фібробластах (Kilbourne et al., 1964) і IB MDBK, гетеро-плоідной лінії клітин бичачої нирки (Choppin, 1969). Вірус грипу В теж здатний розмножуватися в гетероплоідной лінії, отриманої з нирок собак (Green, 1962).

Специфічність відносно клітини-господаря не завжди вдається передбачити. Віруси грипу свиней не розмножуються в культурі клітин нирки людини (Hinz, Syverton, 1959), але віруси грипу людини добре розмножуються в клітинах нирок свиней (Lehmann-Grube, 1964). Культура клітин нирок мавп нечутлива до вірусів грипу коней (Heq2Neq2) при зараженні безпосередньо клінічним матеріалом , але ті ж віруси розмножуються в клітинах нирки мавп після одного пасажу на курячих ембріонах (Dowdle et al., 1963).

Недостатньо повне усунення сироваткових компонентів перед інокуляцією вірусу є однією з головних лрічін виділення вірусу в малому відсотку випадків та отримання низьких інфекційних титрів в чутливих культурах клітин. Компоненти сироватки, що представляють собою необхідну складову частину середовища для росту клітин, можуть неспецифически нейтралізувати вірус. Це найбільшою

мірою стосується вірусів, виділених після 1957 м. Інгібіт-ючий дію сироватки може бути усунуто за допомогою дворазової або багаторазової відмивання клітин середовищем,. що не містить сироватки.

2. Абортивна інфекція

Henle і співавт. ( 1955) першими показали, що клітини HeLa (з карциноми шийки матки людини), заражені при великій множинності розмноженим на курячих ембріонах вірусом, продукують неінфекційні гемагглю-тінірующіе частинки. Абортивна інфекція спостерігається і в клітинах L, заражених FPV (Franklin, Breitenfeld, 1959) , а також у різних лініях клітин, заражених вірусом грипу свиней (Wong, Kilbourne, 1961), виданню клітинах аецітной пухлини Krebs-2 (Low et al:, 1962), в клітинах ВНК-21 (Fra-ser, 1967) і в клітинах BSC-1 (Nikitin et al., 1972). Абортивна інфекція спостерігається не тільки в гетероплоідних клітинах, але також і в диплоїдних фібробластах людини (Kilbourne et al., 1964).

Механізм абортивної інфекції не цілком ясний; ймовірно, блокується якась стадія циклу репродукції вірусу. У дослідах з вивчення неповних циклів репродукції вірусу грипу в клітинах HeLa (Henle et al., 1955) або в клітинах L (Franklin, Breitenfeld, 1959) було відмічено утворення значного кількості як NP-антигену, так і гемагглюті-нірующіх частинок. Loffer і співавт. (1962) показали, що при абортивної інфекції в клітинах HeLa NP накопичується в ядрі, а звільняються вірусні частки не містять повної послідовності нуклеотидів вірусної РНК. Choppin і Pons ( 1970) виявили, що в цих гемагглюті-нірующіх неінфекційних частинках відсутня найбільший з 'фрагментів вірусної РНК, але мається підвищена кількість малих фрагментів РНК-Ці автори також знайшли, що клітини HeLa можуть продукувати інфекційний вірус, якщо в інокуляти відсутня неповний вірус. В цьому відношенні абортивна інфекція в клітинах HeLa схожа з класичним феноменам фон-Mairayea, тобто з продукцією неповного вірусу в курячих ембріонах.

3. персистентно інфекція

Ряд експериментальних даних дозволяє припускати можливість хронічної інфекція, супроводжуваної низьким виходом вірусу, спричиненої вірусами грипу в культурах тканин. Tyrrell (1959) описав хронічну інфекцію культури клітин нирки телят вірусом WS. Гаврилов і співавт. (1972) виявили, що три пасирування жлеток нирок сві-

ній, заражених вірусом WSN, вірус міг бути виявлений протягом 105 днів. Willinson і Barland (1972) показали персистенцию вірусу P.JR8 протягом 50 днів після зараження їм культури «льоток легкого людини. В культурі не розвивався цітоіатіческій ефект, а в культуральній рідині виявлялися невеликі кількості інфекційного вірусу. Такі повідомлення показують, що принаймні деякі штами вірусу грипу можуть викликати розвиток короткочасної хронічної інфекції, але «справжня» персистентная інфекція з вірусом грипу ще не продемонструвала.

4. Параметри інфекції

а) вірусспеціфіческой компоненти в клітці. Метод, флуоресцентних антитіл (ФА), 'запропонований Weller і Coons (1954), широко використовували як імунологічного тесту для 'ідентифікації та локалізації вірусспеці-фических антигенів у заражених' клітинах. Прямі та непрямі методи імунофлюоресценції в застосуванні до вірусів були детально описані в огляді Liu (1969). Раніше інших цей метод застосували до вірусу грипу Watson <і Coons (1954), а також Liu (1955), що показали переважно ядерну локалізацію флюоресценції, обумовлену NP-ан-антигеном в заражених вірусом грипу клітинах. Згодом цей метод широко використовувався при вивченні розподілу антигенів вірусу грипу в різні терміни циклу репродукції вірусу. Маепо і Kilbourne (1970) описали розподіл NP, гемаглютиніну та нейрамінідази. Oxford і Schild (1974) вивчили розподіл всіх чотирьох головних антигенів вірусу, в тому числі М-білка.

  Спроби титрування вірусу грипу в культурі клітин з використанням техніки флуоресціюючих антитіл були зроблені Oxford і Schild (1968), описавши методику "підрахунку інфекційних центрів для оцінки кількості флюоресцирующих клітин.

  Dimmock (1969) виявив-присутність вірусспеціфіче-скаго антигену в ядерцях клітин, заражених вірусом грипу. Антиген може (бути виявлений за допомогою методу ФА при використанні сироваток заражених мишей, але несивороток, приготованих проти вірусних частинок. Флюоресценція в ядерцях з'являлася в ранніх стадіях інфекції і була, на думку автора, обумовлена ??вірусним антигеном, що накопичується В 'заражених клітинах, але не включающимся в вірусні частки.

  Метод ФА вельми чутливий 'І дозволяє визначати,

  малі. кількості антигену або антитіл, але він може давати

  неспецифічне фарбування, тому контрольні препа

  рати строго обов'язкові. Для виявлення певних:

  антигенів необхідно попользовать високоспеціфічеокіе антисироватки, отримані шляхом імунізації очищеними. антигенами.

  Техніка радіоактивної мітки широко застосовувалася для виявлення внутрішньоклітинних вірусних білків при репродукції вірусу грипу. Becht (1969) використовував мітку радіоактивними попередниками і авторадіографію для того, щоб показати переважно ядерну локалізацію NP. Інші автори '(Joss et al., 1969; Taylor et al., 1969; Ske-hel, 1972) використовували радіоактивну мітку і ПААГЕ. Ці дослідження будуть детально описані далі, а тут про них буде лише згадано. Одним з найбільш результативних методів було застосування 358-метіоніну, який ефективно включається в вірусні білки. Skehel (1972), застосувавши цей метод, виявив синтез 9 поліпептидів в клітинах, заражених вірусом грипу. Сім з них відповідають відомим структурним поліпептидам вірусу. Два поліпептиду (8 і 9) не можуть бути ототожнені із структурними компонентами вірусу; вони були полічені вірусзакодірованнимі продуктами, не включає в вірусні частки. Ці компоненти виявляються незабаром після зараження (Skehel, 1973), але їх значення для інфекційного процесу невідомо.

  Такі методи, як мітка іммуноферрітівом з подальшою електронною мікроскопією, не дали істотних результатів при спробах ідентифікації внутрішньоклітинних антигенів у клітинах, заражених вірусом грипу. Одним з головних перешкод тут було неелеціфіческое зв'язування іммуноферрітіна з білками кленкі. Ці методи, однак, були успішно іспользова'ни для ідентифікації вірусних антигенів на поверхні клітини.

  б) Вірусні компоненти на поверхні клітини. Техніка гемадсорбції (Had), запропонована Vogel і Shelokov (1957), є чутливою для виявлення гемаглютиніну на поверхні інфікованої клітини. При цьому методі еритроцити морських свинок, курчат або людини вносять в інфіковану культуру клітин, яку потім промивають і інкубують в середовищі, що не містить сироватки. Наявність вірусу визначають по присутності груп еритроцитів, пов'язаних на поверхні клітинного шару. Слід використовувати такі еритроцити, які агглютинируются даним вірусом. Найбільш широко для (гемадсорбції використовували культуру клітин нирок мавп і телят. Культура клітин курячого ембріона може бути застосована для деяких штамів вірусів хрипкий типу А птахів. Had є корисним і чутливим методом для виявлення вірусної інфекції, але слід мати на увазі; можливість контамінації культур темагглютінірующімі агентами, наприклад віз-

  ливість присутності вірусу SV5 в культурі клітин нирок мавп. Крім того, старі еритроцити неспецифически адсорбуються на клітинах нирок в культурі (Dowdle, Robinson, 1966). Had широко застосовується в якості методу титрування інфекційності вірусу грипу. Слід зазначити, що штами, що проходять неповний цикл реплікації, в деяких клітинах господаря можуть тим її 'Менш викликати Had в цих культурах.

  Синтетичний хромогенний субстрат нейрамінідази 2 - (3-метокеіфеніл)-N-ацетілнейраміновой кислота (MPN) (Tuppy, Palese, 1969) знайшов застосування для визначення активності нейрамінідази в культурі при реплікації вірусу грипу. Palese і співавт. (1970) вдалося ідентифікувати фокуси розмноження вірусу в одношарової культурі за допомогою додавання MPN я діазоніевой солі 4-аміно-2 ,5-ді-метокси-4 /-нітроазО'бенз. Ала. Ці фокуси забарвлювалися в червоний колір, оскільки 3-метоксіфенол, звільняється з MPN під дією NA *, реагував з діазоніевой сіллю, даючи червоне забарвлення. Фокуси активності NA *, тобто осередки розмноження вірусу, могли бути виявлені цим методом навіть при відсутності локального цитопатического ефекту.

  Цей метод може бути використаний при вивченні генетики. Palese і Schulman (1974) за допомогою MPN-хромофорного методу ідентифікували два типи інфекційних вогнищ в одношарової культурі лінії клітин 'Кон'юнктиви людини, зараженої клонованою рекомбінантов вірусу грипу. Були виявлені яскраво і слабоокрашенниє ділянки, що відповідають двом генетично різним компонентами вірусної популяції, які мають відповідно високе і низьке співвідношення активностей NA * і НА *.

  Метод ФА нерідко використовується для виявлення антигенів вірусу грипу на поверхні / клітин. Необхідно, щоб при цьому оболонка клітини не ушкоджувалася, що запобігає проникненню в клітину реагентів. Rutter і Mannweiler (1973) описали появу вирусспецифических антигенних детермінант на (поверхні клітин HeLa, заражених вірусом грипу; при цьому використовували непряму иммунофлюоресценцию і нефіксовані клітини. Флюоресценції виявивши а ля на поверхні клітин через 4 год; після зараження; через 8 год вона досягала максимуму . Oxford (ПП) виявив інтенсивне свічення на поверхні заражених клітин MDBK та первинної культури клітин нирки теляти при використанні антисироваток проти очищених NA * і НА *. На підставі отриманих даних неможливо було з достовірністю говорити про різному розподілі цих антигенів на поверхні клітини, хоча флюоресценція при використанні сироватки: проти темаглютініна була сильнішою, ніж при використанні антінейра-мінідазной сироватки, що, мабуть, вказує на більшу кількість НА на поверхні клітини в порівнянні з кількістю NA. Хоча Rutter і Mannweiler виявили «полярне» скупчення антигенів вірусу грипу на одній стороні клітини, в дослідах Oxford; та НА * і NA * були розподілені рівномірно.

  Для визначення антигенів вірусу грипу на поверхні заражених клітин за допомогою електронної мікроскопії Morgan і співавт. (1961) використовували іммуноферрітіновий метод із застосуванням протигрипозної сироватки, кон'югі-рова з феритином. Подібні методи можна застосовувати і для специфічної цдентіфікаціі антигенів на поверхні клітин при використанні антисироваток проти очищених вірусних антигенів: НА *, NA *, NP і білка мембрани ..

  в) Вірусні компоненти, що звільняються з клітин. Звільнення синтезованих вірусних частинок з поверхні заражених клітин здійснюється шляхом «брунькування» на: протягом тривалого періоду, починаючи з 5-6-го години після зараження. Заражені клітини поступово дегенерують з розвитком цитопатичних змін. Крім вірусних частинок, в культуральне середовище може виходити і «розчинна» Р-антиген. За виходом вірусу і «розчинної» антигену можна стежити, визначаючи наявність вирусспецифических компонентів у культур ал ьной рідини але біологічної активності, або по присутності вірусепеціфіческіх антигенів. Найчастіше для визначення динаміки виходу вірусу з клітин використовують тест гемаглютинації (Hirst, 1941). Визначення активності NA * застосовують для цієї щілини лише в тих випадках, коли ставиться спеціальна завдання.
трусы женские хлопок
 Обидва етіх.теста дозволяють визначити головним чином наявність вірусних частинок. Зв'язування комплементу (РСК) часто застосовують для виявлення вірусного антигену в культур а ль-ної рідини, причому використовують антитіла до NP або антитіла до поверхневих антигенів (У-антисироватки). Можуть бути використані і антисироватки до очищеним гемагглю-Тинина і нейрамінідазі. Орі цьому виявляються як вірусні частки, так і вільні поверхневі антигени, в той врехМЯ як при використанні антитіл ок білкам NP я М виявляються в основнОхМ «розчинні» антигени, а не вірусні частки. Характеристика етих систем при визначенні біологічних властивостей вірусу і кількісному вимірі грипозних антигенів описана в гол. 12.

  Інфекційні вірусні частки виявляють за допомогою того чи іншого методу титрування інфекційності. Найчастіше застосовують найбільш чутливий метод визначення кінцевої точки титрування «а курячих ембріонах .. Зараження курячих ембріонів описано в розділі II, Г цій

  глави. Інфекційну 50% дозу для ембріонів (ЕІД50) розраховують за кількістю ембріонів, заражених три інокуляції кожного розведення, за звичайною формулою (Reed, Muench, 1938). Титри виражаються в ЕІД50 на 1 мл рідини. Титрування інфекційності можна проводити з використанням методу культивування фрагментів хоріон-аллантоісвой оболонки на шкаралупі (Fazekas de St. Groth, White, 1958), який описаний далі, однак цей метод менш чутливий, ніж титрування на ембріонах. Титрування вірусу можна також проводити в культурі клітин способом, аналогічним титруванню на ембріонах, але з визначенням інфікування культури по гемадсорбції, як описано раніше.

  Цитопатичної ефект рідко 'використовується як показник зараження культури вірусом грипу. Ці ефекти (Pereira, 1961) варіюють в широких межах у різних штамів і на різних культурах. Оскільки вони мають звичайно характер дегенеративних змін з грануляцією цитоплазми, вакуолізацією, пікнозом ядер, зморщуванням і дезінтеграцією клітин, кінцева точка титрування не може бути визначена з точністю. Описано базофільні ци-топлазматіческіе включення в клітинах, заражених вірусом грипу А, але вони теж варіюють (Soloviev, Alekseeva, 1960). Базофільні цитоплазми а тично <кі включення часто спостерігаються також в «льотках, заражених деякими штамами вірусу грипу В (Porebska et al., 1968).

  Для деяких вірусів грипу, як, наприклад для FPV або для нейротронних варіантів людських штамів NWS і WSN, визначення інфекційності може бути здійснено підрахунками бляшок в монослойной культурі клітин з використанням будь-якої з методик, описаних у розділі ІВ. При використанні методу бляшок можна знати його чутливість по відношенню до титрування на ембріонах. Для перерахованих вище штамів це співвідношення приблизно дорівнює 1: 1, але для більшості штамів, виділених у людини, і для більшості використовуваних для бляшок систем відносна чутливість низька.

  Б. МЕТОД НЕГАТИВНИХ КОЛОНІЇ [бляшками]

  Здатність вірусів грипу до утворення бляшок широко варіює. Багато віруси не утворюють бляшок, а ті, які утворюють, мають досить низьку ефективність бляш-кообразованія, особливо віруси грипу А. Здатність до утворення бляшок є індивідуальний ознака штаму незалежно від приналежності до того-чи іншого серотипу.

  Було описано утворення бляшок в первинних культурах фібробластів (Simpson, Hirst, 1961), легень (Granoff, 1955) і нирок (Wright, Sagik, 1958) журіносго ембріона. Фіб-робластах курячого ембріона успішно використовувалися головним чином в роботі з нейротропним штамом NWS і з кількома багаторазово пасеровані лабораторними штамами вірусів грипу типів А і В. Навпаки, клітина нирок курячого ембріона є непоганою системою для отримання бляшок з багатьма штамами вірусів грипу типу A (Beare , Keast, 1974).

  Освіта бляшок деякими вірусами грипу А і В у монослое клітин курячого ембріона можна підсилити обробкою клітин ферментами: панкреатином (Came et al., 1968) або трипсином (Tobita, Kjlbourne, 1974). Механізм дії цих протеолітічеокіх ферментів неясний. Можливо, що вони модифікують поверхню клітини, роблячи її більш чутливою до адсорбції і проникненню вірусу,, або ж руйнують якийсь ингибирующий фактор, асоційований з кліткою або залишається після видалення середовища росту, містить сироватку.

  Клітини почак сирійського хом'яка були описані в якості системи, високочутливої ??до вірусів грипу А (Grossberg, 1964), причому віруси утворювали бляшки без 'попередньої адаптації. Надалі, проте, про будь дослідах, проведених з цими клітинами, не повідомлялося,

  Дві системи найбільш широко застосовувалися для бляшко-освіти з різними вірусами. Грипу: первинні культури клітин нирок мавп і бичачих почак. 'Більшість штамів вірусів грипу типів А і В, виділених і пасеровані на інших господарях, не утворюють бляшок на клітинах нирок мавп, проте багато штами можуть' бути адаптовані і починають утворювати бляшки після декількох пасажів (Henry, Youngner, 1957; Choppin, 1962) . Було висловлено припущення (Takemoto, Fabish, 1963), що неефективне бляшкоутворення вірусами грипу типу А обумовлено гальмуванням адсорбції вірусу на клітинах, що викликається Сульфатовані полісахаридами агару. У деяких штамів кількість і розмір бляшок значно увеличи-. валися при додаванні ДЗАЕ-декстрану в агар для зв'язування інгібіторів. Цей інгредієнт зараз використовується як: складова частина агарового шару в більшості систем.

  Клітини нирок теляти, як зазначав ще Lehmann-Grube:

  (1963) і недавно підтвердили Веаг і Keast (1974), являють

  ся високоефективною системою для бляшкоутворення, ви

  званого вірусом грипу В. Однорідність результатів,

  отриманих з різними штамами грипу В, контрастує

  з широко варьирующими результатами, одержуваними з раз

  вими штамами вірусів грипу А. Про необхідність адап

  тації вірусу грипу А для отримання бляшок в культурі

  бичачих нирок достовірних даних немає.

  З цих двох культур клітини 'нирок мавп володіють кращими якостями щодо зростання і здатності переносити лабораторні. Маніпуляції. Клітини 'бичачих нирок добре ростуть, wo легко відокремлюються від скла після утворення' помилки моношарами.

  Усі первинні культури «льоток мають загальний недолік - вони неоднорідні за складом і,-крім того, чутливість до вірусів може сильно 'відрізнятися в культурах, отриманих від різних особин. Деякі клітини (особливо «льотки нирок мавп і бичачих нирок) нерідко виявляються жонтаминированнымипосторонними агентами. В 'принципі ці перешкоди можуть бути усунені при роботі з ге-тероплоідной лінією клітин. Варіант Wong-Kilbourne лінії клітин Чанга (клітини кон'юнктиви людини) був успішно використаний для бляшкоутворення з вірусами грипу А і В ((Sugiura, Kilbourne, 1965). На клітинах цієї лінії утворюють бляшки і штами вірусу грипу типу A (H3N2) з клінічного матеріалу (Rytel, Sedmak, 1973). Хоча пасаж через гетероплоідную лінію клітин робить вірус непридатним для вивчення на людях або для живої вакцини, ці дані мають істотне значення для генетичних досліджень і серологічних тестів.

  В. органних КУЛЬТУРИ

  Одношарові і суспензійн культури складаються з недиференційованих клітин і тому рідко зберігають спектр 'Чутливості до вірусів, характерний для того органу, з якого вони' отримані. Органні культури являють собою шматочки органів ембріона або дорослої тварини, підтримувані in vitro без проліферації клітин і зберігають тому той спектр чутливості до вірусів, який даний орган має in vivo. , З цієї причини органні культури виявляються дуже корисними системами для вивчення in vitro взаємодії між вірусом і чутливими клітинами господаря.

  Найбільш великі дослідження з 'використанням різних органних. Культур, отриманих від одного і того ж виду тварин (тхір), описані в повідомленнях Basarab і Smith (1969, 1970), Gould і співавт. (1972), Toms і зі авт. (1974). Органні-культури носових раковин, сечового міхура, матки, трахеї, легенів, кон'юнктиви, яйцевода та стравоходу володіли спадної в цьому порядку чутливістю до вірусу грипу A (H2N2), вирощеному m курячих ембріонах. Тканини травного тракту були нечутливі, за винятком стравоходу і глотки, які могли бути заражені при використанні високої дози зараження. Нечутливими опинилися також м'язова, 'ретикулоендотеліальна тканину, кровоносні судини і нирка. У дослідах, поставлених in vivo, при інтраназальному зараженні вдавалося інфікувати тільки носові раковини, легкі, трахею і стравохід, причому більша частина виявляється вірус містилася в носових раковинах. Сечовий міхур і матка не були інфіковані, хоча, як було показано раніше, органні культури цих тканин чутливі до вірусу в такій же мірі, <як і 'респіраторні тканини. Обидва цих органи можуть-бути інфіковані при прямій урогенітальної інокуляції вірусу (Basarab, Smith, 1970). Зараження урогенітальних тканин вірусом грипу можливо не тільки у тхора. Rostoczy я співавт. (1973) виявили, що вірус грипу типу А здатний розмножуватися і в органної культурі ембріонального ендометрію людини.

  Оскільки тканини респіраторного тракту є головним 'місцем розмноження вірусу in vivo, органні культури, отримані з цих тканин, привертали найбільшу увагу дослідників. Фрагменти слизової з війчастим епітелієм, отримані з трахеї і носової порожнини ряду тварин, виявилися здатними підтримувати досить активну реплікацію вірусу грипу; до фрагментів легеневої тканини це стосується меншою мірою. Обговорення використання органних культур для розмноження вірусу і перерахування використаних культур можна знайти в огляді Ноогп і Tyrrell (1969). Методи приготування органних культур описані там же, а також Cherry і Taylor-Robinson (1970).

  Дані з оцінки 'ефективності клітин миготливого епітелію для виділення вірусів грипу дуже нечисленні. У тих обмежених дослідженнях, які проводилися в цьому напрямку, не виявлено помітних переваг органної культури трахеї ембріона людини перед первинної культурою нирок макак резусів для виділення вірусів грипу A (Roome et al., 1971) або В (Votava, Tyrrell, 1970). Крім того, культуру трахеї людини важче отримувати і вона менш зручна в обігу, ніж звичайні культури клітин.

  Було проведено порівняння органних культур трахеї курячого ембріона з первинною культурою клітин нирки зеленої мавпи для виділення вірусу грипу A (Blascovic et al., 1972b). Приблизно однакова кількість штамів було виділено в кожній системі, так само як в обох системах. Автори запропонували використовувати обидві системи для виділення максимальної кількості штамів. Використання органної культури трахеї курячого ембріона не порівнювати із звичайним зараженням курячих ембріонів, яке незрівнянно простіше.

  Оскільки чутливість тканин до вірусів в органних культурах подібна до такої в интактном організмі, по-

  лагают, що і дія противірусних речовин повинно бути схожим. Якщо це так, то органні культури повинні виявитися корисними для оцінки дії противірусних препаратів. Тут, однак, є як позитивні, так і негативні сторони. 'З одного боку, фрагмент органу, віддалений з організму, не береться під нормальної фізіологічної регуляції, що може відбитися на ефективності препарату. З іншого боку, концентрація препарату та тривалість контакту можуть краще контролюватися в органних культурах. Tyrrell і співавт. (1965) першими використовували Війчастий епітелій людини в органної культурі для оцінки in vitro дії протигрипозного препарату (амантадин). Herbst-Laier (1970) досліджував широке коло органних культур, включаючи експлантати трахеї мишей, хом'яків, тхорів, щурів, собак, мавп, свиней «телят, а також носових раковин собак і тхорів. З них найбільш придатними для оцінки розмноження (і його придушення) прототипну штамів вірусів типів А і В виявилися органні культури трахеї собак і тхорів. У культурі трахеї собак виявлялися специфічні гістологічні зміни, які автор розглядає як більш надійний критерій оцінки, ніж титр вірусу як такої. Характерні і постійні цитопатична зміни були також виявлені Blascovic і співавт. (1972а) в органних культурах трахеї курячого ембріона, заражених вірусом грипу А (Гонконг/68); це дозволяє вважати, що і дана культура може виявитися корисною.

  Використання органних культур миготливого епітелію було запропоновано для визначення спектру господарів знову виділених штамів вірусу грипу A. Schmidt і співавт. (1974) повідомили, що при зараженні таких культур, отриманих з органів курей, коней, тхорів і свиней, вірусами, виділеними 'у. людей, свиней коней і птахів, чутливість культур корелювала з пассированием штаму в тому чи іншому хазяїні в природних умовах.

  Органні культури можуть бути використані і для відбору штамів-кандидатів для отримання живих вакцин. Mos-tow і Tyrrell (1973) описали певну кореляцію між-'ду здатністю вірусу знижувати рухливість війок епітелію і пошкоджувати клетмі в органної культурі трахеї ембріона людини і його здатністю викликати захворювання у людей. Ця кореляція, однак, не спостерігалася з органними культурами тхорів і не поширювалася на всі штами вірусів грипу (Нага et al., 1974). Віруси грипу типу В знайшли однакову патогенність для органних культур трахеї людини при різній вірулентності для людей. Тому видається очевидним, що, хоча органні культури мають багато достоїнств для вірусологічних

  дослідженні, не можна вважати, що орган, розрізаний на кусачки і підтримуваний поза організмом в штучному середовищі, реагує на інфекцію точно так само, як в интактном організмі.

  Г. КУРЯЧИЙ ЕМБРІОН

  Курячі ембріони широко використовуються для виділення і розмноження вірусу ще з часу першого опису зараження в порожнину амніону (Burnet, 1940). Класична робота Beveridge і Burnet з культивування вірусів і рік-КЕТС в курячому ембріоні була опублікована в 1946 р. З тих пір майже не було отримано істотних доповнюючих даних.

  Деякі ранні рекомендації зараз виглядають, однак, застарілими у зв'язку з біологічної мінливістю вірусів грипу. У 40чх тодах для виділення вірусів грипу типів А і В рекомендувалося зараження 13-14-денних ембріонів в порожнину амніону, а для адаптованих в лабораторії штамів - зараження в порожнину аллантоиса 10 - 12-денних ембріонів. Аж до 1968 р. виділення вірусів грипу А і В можна було здійснити, як правило, лише за допомогою зараження в порожнину амніону і для успішної адаптації було потрібно багато пасажів. Дуже рідко виділяли штам шляхом зараження в порожнину аллантоиса. З 1968 р. людські штами вірусу грипу А виділяються з однаковою легкістю при обох шляхах зараження: введення матеріалу в порожнину амніону не дає ніяких переваг. Відносно вірусу грипу типу В протягом багатьох років теж можна спостерігати зміни. Оскільки важко передбачити заздалегідь нахил штаму того чи іншого вірусу до розмноження при певному способі введення, в якості стандартної процедури рекомендується зараження 11-денних ембріонів в порожнину як амниона, так і аллантоиса.

  Неадаптовані віруси, введені в амніон 13-денних ембріонів, розмножуються спочатку в трахеї і легень. Вони можуть викликати загибель ембріона, але можуть і не викликати її. Віруси, багаторазово пасеровані цим шляхом, розмножуються в амніотичної оболонці і епітеліальних покривах ембріона, а також в респіраторних шляхах, викликаючи множинні крововиливи і швидку загибель його. Після кількох пасажів штам набуває здатність розмножуватися при зараженні в порожнину аллантоиса.

  Штами, що не адаптовані до курячого ембріону (фаза О-від original, тобто вихідна), нерідко дають більш високі титри гемаглютиніну з еритроцитами морської свинки або людини, ніж з курячими еритроцитами. 'Після адаптації (фаза D - від derived, тобто похідне) вірус зазвичай

  агглютинирует курячі еритроцити до тих же титрів, що еритроцити ссавців. Цей перехід із фази О в фазу D (Burnet, Bull, 1943) утворилася не 'завжди. Більшість штамів вірусів грипу А і В, виділених після 1968 р., агглютинируют еритроцити морокою свинки і курячі еритроцити до однакових титрів.

  Адаптовані віруси, введені в порожнину аллантоиса подневная курячого ембріона, розмножуються предже всього в ентодермальних-клітинах хоріон-аллантоісной оболонки, хоча вірус можна виявити також у клітинах амніотіче-ської оболонки і респіраторних шляхів.

  Накопичення вірусу в порожнині аллантоиса має очевидні переваги, оскільки виходить великий обсяг вірусеодержащего матеріалу і його легко збирати. Добре адаптовані штами можуть давати 109-1011 вірусних частинок на 1 мл. Вірус однаково добре розмножується в ембріонах від 10 - до 13-дневното віку, але обсяг аллан-тоіеной рідини різко зменшується, починаючи з 13-го дня. Крім того, у ембріонів 'більш раннього віку міститься менше солей сечової кислоти ш аллантоісной рідини; в міру розвитку ембріона їх зміст наростає. Ембріони, заражені в 12 - '13-денному віці, містять аллантоісную рідина, яка мутніє відразу після охолодження; за кілька днів у ній утворюється рясний осад. Опади-солей сечової кислоти містять вірус і їх утворення може різко знижувати титр вірусу в рідині.

  Величина заражающей дози вірусу-може істотно впливати на його урожай. Рекомендується використовувати дози від 104 до Ю5 ЕІД50 на 1 мл. При використанні більш низької дози урожай вірусу може бути низьким, а динаміка репродукції-нерівномірною. Більш високі заражають дози можуть вести, до зниження врожаю (Miller, 1944). При цьому може також розвиватися ефект фон Магнуса (von Magnus, 1952), тобто збільшення відношення неінфекційних часток <до інфекційних. Цей феномен обговорюється в гл. 1.

  Для деяких спеціальних досліджень може виявитися необхідним культивування (вірусу в клітинах оболонки аллантоїса без репродукції вірусу в інших тканинах ембріона. Для'такіх досліджень можуть використовуватися. Деембріо-вані яйця (Bernkoff, 1949). Однак урожай вірусу в них набагато нижче, ніж в ннтактних ембріонах, і цей метод не може бути рекомендований для постійного використання.

  Д. ФРАГМЕНТИ ХОРІОН-аллантоісной ОБОЛОНКИ НА яєчної шкаралупи

  Оскільки експерименти, що вимагають зараження великої кількості курячих ембріонів, дороги і трудомісткі, переваги техніки, що дозволяє провести такий же досвід з викорис-

  зованием фрагментів одного яйця, очевидні. При цьому досягається і однорідність тканини, оскільки знімається проблема неоднакової чутливості різних ембріонів до вірусу.

  Fulton і Armitage (1951) першими запропонували спосіб розрізання хоріон-аллантоісной оболонки (ХАО) на маленькі шматочки і їх підтримки в чашках на пластикових дошках, але титри вірусу при цьому (були значно нижче, ніж в интактном ембріоні. Fazekas de St. Groth і White (1958) поліпшили методику, змінивши середовище і використавши шматочки, не відокремлені від шкаралупи. (При цьому шкаралупа забу-ферівала середовище і служила опорою для тканини; експонувалася максимальна поверхню, причому тільки та сторона оболонки, яка чутлива до вірусної інфекції. Інфекційні титри більшості штамів грипу А в такій системі не поступаються титрам: в интактном ембріоні. Розмноження вірусу грипу В йшло менш успішно. Ця методика особливо зручна для титрування інфекційності і для реакції нейтралізації з вірусом грипу А, а також для швидкого виділення і клонування рекомбінантов вірусів грипу A (Webster, 1970).

  Ш. КРУГ ГОСПОДАРІВ СЕРЕД ЛАБОРАТОРНИХ ТВАРИН

  А. тхорів

  Вірус грипу людини А був вперше виділений на тхорах (Smith et al., 1933). З тих лор тхорам приділяли багато уваги, спочатку як засобу виділення вірусу, а пізніше як моделі для вивчення патогенності та імунології грипу.

  Тхори Високовоспріімчівость до зараження вірусами грипу типу А. Інтраназальне введення інфекційного вірусу викликає через 48 год температурну реакцію, яка може тривати від 24 до 72 ч. У тварин у цей період розвиваються симптоми грипу: риніт, чхання, нежить, втрата апетиту, млявість. Вірус виділяється в зовнішнє середовище протягом перших днів захворювання і легко може передаватися незараженим тхорам і людям (Smith, Stuart-Harris, 1936). Тхори можуть заражатися від людини природним шляхом при контакті, тому при експериментальному зараженні слід заздалегідь переконатися ш відсутності у них антитіл до циркулюючих серед людей вірусам грипу.


  Повідомлялося, що тхори були високочутливі до вірусів грипу А, що переважали в середині 30-х років, але менш чутливі до більш пізнім штамів АЛЕ, до штамів HI і до вірусу грипу В (Hirst, 1947b; Sugg, Nagaki, 1955). Можливо, що це дійсно так, але скільки-небудь систематичних досліджень з використання тхорів для виділення вірусів А і В не проводилося після початку 40-х років. До того часу техніка використання курячих ембріонів набула широкого поширення, і, природно, застосування, тхорів для виділення вірусу 'вийшло з ужитку.

  Тхори, однак, залишаються широко використовуваної моделлю для вивчення грипу людини. Картина захворювання у тхорів вельми схожа з такою у людини (Shope, 1934, Francis, Stuart-Harris, 1938; Liu, 1955; Sugg, Nagaki, 1955; Haff et al., 1966). Різні штами вірусів грипу викликають широкий спектр аслініческіх проявів хвороби. Реакція на зараження варіює від ліпленням бестемпературной респіраторної інфекції з вогнищевими гістологічними змінами в передній частині носових ходів (Haff et al., 1966) до гострої температурної реакції з швидким розвитком некрозу і відторгненням клітин миготливого епітелію (Shope, 1934; Francis, Stuart-Harris, 1938) і навіть до вірусної пневмонії с. руйнуванням клітин, що вистилають альвеоли (Hers, 1963; Mulder, Hers, 1972). Раніше за допомогою світлової мікроскопії ^ отримані дані про вірусопеціфічеекіх патологічних змінах епітелію дихальних шляхів були пізніше підтверджені електронно-мікроскопічними дослідженнями (Hotz, Bang, 1957) і методом флуоресцентних антитіл (Liu, 1955).

  При інтраназальному зараженні вірус розмножується в носових раковинах, легких, трахеї, стравоході (Haff et al., 1966; Basarab, Smith, 1969). Вірус виявлявся тільки в цих тканинах, хоча інші (сечовий міхур, матка, кон'юнктива) теж сприйнятливі ж нього. Переважне розмноження вірусу в тканинах респіраторних органів спостерігається навіть при внутрішньовенному або внутрішньосерцевому введенні вірусу (Basarab, Smith, 1969). Переважне зараження саме респіраторної тканини було також підтверджено Barber і Small (1974) в досвіді, при якому сформована хірургічним шляхом сумка з тканини трахеї пересаджувалася під шкіру. Вірус вражав як трахею, так і імплантували тканину трахеї незалежно від шляху зараження. Пасивна імунізація сироваткою тхорів, що містила антитіла проти вірусу, що не запобігала поширення вірусу гематогенним шляхом.

  Зараження тхорів вірусом грипу до підвищення вмісту білка і короткочасного появи нейтралізують антитіл у змивах з носа, <а також до швидкого підйому рівня нейтралізують антитіл IB сироватці. Після одужання тхори Імунозахищені до повторного зараження гомологічним вірусом (Smith et al., 1933; Francis, Stuart-Harris,

  1938; Haff et al., 1966; Marois et al., 1971). Оскільки це досить близько нагадує реакцію на зараження у людини, відновився інтерес до зручної моделі для вивчення імунітету і методів імунізації. Potter et al. (1972a, b) і Potter (1973) у серії повідомлень описали відсутність захисного ефекту при внутрішньом'язовому введенні водної інактивує-ванній вакцини. Імунізація з використанням ад'юванта забезпечує деяку ступінь захисту і викликає підйом рівня антиген-аглютинінів в сироватці, але імунітет при цьому не настільки виражений, як після перенесеного захворювання. Це загалом відповідає даним, отриманим на людях, і дозволяє вважати, що відсутність повного імунітету при використанні убитої вакцини обумовлено її нездатністю викликати появу антитіл в секреті слизової оболонки носа. Антитіла в змивах з носа постійно виявляються при природному захворюванні (Haff, 1973).

  Б. ГРИЗУНИ

  Білі швейцарські лінії мишей використовувалися як лабораторна (модель для вивчення вірусів грипу людини протягом 40 років (Andrewes et al., 1934; Francis, 1934). Переваги використання мишей очевидні: малі розміри і низька вартість допускають такі лабораторні дослідження, які були б неможливі при використанні більш великих і дорогих тварин, наприклад тхорів.

  На відміну від тхорів миші не володіють високою сприйнятливістю до вірусу грипу. Інтраназалиное введення інфекційного матеріалу від хворих людей не викликає вираженої картини захворювання у мишей, хоча вірус може розмножуватися в легенях, бронхіолах, трахеї і, меншою мірою, тканинах носової порожнини (Hirst, 1947a; Lida, Bang, 1963; Mulder, Hers, 1972 ). Оскільки розмноження вірусу може бути засвідчено лише за допомогою титрування in ovo або in vitro, не можна вважати, що виділення (вірусу шляхом зараження мишей має якісь переваги .. Однак після адаптації, що вимагає шести або більше пасажів легеневого екстракту, віруси грипу типу А починають викликати яскраво виражені патологічні зміни в легенях, а також загибель тварин вже через 48 год після інтра-назального зараження. Віруси грипу типу В важче адаптувати до легких миші. Ці виражені патологічні зміни, викликані вірусом трілпа А,. є генетичною ознакою, але якому йде відбір , причому ця ознака незалежний від здатності вірусу розмножуватися в легенях. Високі титри вірусу можуть бути отримані в легенях при зараженні неадаптованих штамом, але розмножений-

  ня при цьому не 'веде до розвитку патологічних змін і загибелі (Hirst, 1947a).

  Дещо інша картина спостерігається яри адаптації до мишей вірусу, вирощеного в курячому ембріоні. Перше інтраназалигое зараження зазвичай викликає розвиток (поразок у лісовиків та загибель тварини, в той час як кілька наступних пасажів не викликають патологічних змін. Це явище можна пояснити токсичністю масивної дози вірусу, який (присутній в аллантоісной рідини у високій концентрації. В організмі мишей накопичується при цьому дуже мало вірусу (Sugg, 1950). Специфічні ураження легень і загибель мишей відзначаються лише після 4-10 додаткових пасажів легеневої тканини.

  Поразки легких, викликані вірусами грипу у мишей, являють собою справжню вірусну пневмонію, схожу во (Багатьох відносинах на вірусну пневмонію у людини (Loosli, 1949; Mulder, Hers, 1972). Дані, отримані раніше за допомогою світлової мікроскопії та вказували на специфічне ураження клітинного покриву альвеол, були підтверджені методом флуоресцентних антитіл (Albrecht et al., 1963) і електронною мікроскопією (Plum-raer, Stone, 1964). Хоча ЮСІ клітини респіраторного тракту чутливі до 'вірусу, є дані про те, що у людини (см . гл. 13) клітини аливеол є місцем початкового розмноження вірусу (Albrecht et al., 1963). Цей незвичайний висхідний шлях респіраторної інфекції, можливо, є скоріше удаваним, ніж реальним. Коли тварині під наркозом интраназально вводять вірус, він розподіляється по всьому респираторному тракту. Розмноження вірусу може-бути більш швидким в легенях, ніж в війчастому епітелії верхніх дихателиних шляхів.

  При сублетальні інфекції вірус починає зникати з легенів через 7 днів, що збігається з появою гуморальних антитіл. У процесі одужання епітелій альвеол заміщається циліндричними і кубічними клітинами. Миготливого епітелію бронхіол. Спостерігається також метаплазія з появою плоского епітелію (Baskerville et a]., 1974).

  Оскільки повітряно-крапельна передача інфекції від заражених тварин до незараженим відбувається> протягом декількох днів контакту, миші. Являють собою прекрасну модель для вивчення передачі вірусу (Schulman, 1969). Миші широко застосовувалися також для вивчення вакцин (Eddy, 1947; Kage et al., 1969), механізмів імунітету (Schulman et al., 1968) та противірусних препаратів (Da-vies et al., 1966; Suganuma, Ishida, 1973).

  Віруси грипу типу А легко розмножуються в легенях хом'яків при мінімальних ознаках захворювання (Friedewald, Hook, 1948). Ті небагато штами вірусу грипу В, які вивчалися в цьому відношенні, володіли лише незначною патогенностью, «про після адаптації могли викликати ураження легень (Friedewald, Hook, 1948; Davenport, 1951; Kilbour-ne et al., 1951). У зв'язку з низькою патогенністю вірусів грипу для хом'яків ці тварини рідко використовувалися для експериментальних робіт з грипу. Проте нещодавно було виявлено, що хом'яки особливо зручні для оцінки темпера-турочувствітельних штамів як придатних для використання як вакцини '(Mills,' Chanock, 1971). Хом'як - одне з небагатьох лабораторних тварин, що мають температуру тіла 37 ° С. Як і у тхорів, у хом'яків НЕ виробляються антитіла при введенні водної вакцини, якщо тільки не було попередньої зараження вірусом грипу типу А (Potter et al., 1973).

  Деякі інші гризуни також використовувалися. Stuart-Harris (1937) повідомив, що вірус (грипу може розмножуватися в тканини носових раковин щурів і морських свинок, але не викликає деструкції епітелію.

  В. ПРИМАТИ (ОКРІМ ЛЮДИНИ)

  Використання мавп в якості експериментальної моделі для вивчення грипу йшло з перемінним успіхом. Ще в 1937 р. Mclntosh і Selbie намагалися викликати захворювання у макак резусів і зелених мавп вірусом H0N1, але безуспішно. Зараження макак резусів і ціномольгус вірусом A/FM/1/47. (. H1N1) дало такий же результат. Клінічних проявів хвороби не спостерігалося, але були відзначені характерний некроз і десквамація епітелію (Verlinde, Makste-nieks, 1954).

  Saslaw і Carlisle (1965) повідомили, що при зараженні аерозолем вдається отримати більш чіткі результати; цей шлях зараження вони розглядали як більш природний, ніж інтраназальний або Інтратрахеально. Вони змогли заразити мавп макак (резусів і ціномольгус вірусом типу A/PR8/34 (H0N1). Спроби заразити мавп штамами вірусу H2N2 і вірусу грипу В були безуспішними. Berendt (1974) теж використовував аерозолі з малим розміром частинок і повідомив, що у 6 макак резусів, заражених вірусом типу А/Гонконг/68 (H3N2), спостерігалося виділення вірусу в зовнішнє середовище і (поява антитіл. Явних клінічних проявів хвороби не було. Всі тварини були Імунозахищені до повторного зараження.

  Кенійські павіани (Papio sp.) Виявилися чутливими до зараження штамом H3N2, подібним А/Гонконг/68 (Kalter et al., 1969). Вірус був виявлений у змивах з глотки; крім того, у заражених тварин і у тварин, со-

  державшихся в сусідніх клітинах, з'явилися антитіла до вірусу. Клінічно вираженого захворювання не було.

  Серед приматів гібони, © ідімо, потенційно є однією з найбільш вдалих. Моделей грипу (Johnsen et al., 1971). Невелика група тварин, заражених штамом А / То 'Нконг/68, не виявила явних' ознак хвороби, але через 2-3 тижнів респіраторні захворювання поширилися по всій колонії гібонів. Відзначалися риніт, кашель, депресія, схуднення, шлунково-кишкові розлади. Хвороба тривала в середньому 3-6 днів і одужання іноді затягувалося. Чотири гібона загинули. Спектр клінічних проявів був дуже близький до спостережуваного у людей. Друга група тварин, що отримала вірус А/Япо-нія/305/57 (H2N2), що не заразилася.

  У більшості випадків для зараження мавп використовувалися лабораторні штами, що пройшли багато пасажів в курячих ембріонах, мишах, тхорах або послідовно на різних об'єктах. Мавпи, можливо, були настільки ж чутливі до цих штамів (ймовірно, аттенуіраванним), як людина. Чи можна успішніше заразити мавп при використанні вірусу, безпосередньо отриманого у людей, невідомо. Серологічні дослідження, проведені на зелених мавп і макаках резус незабаром Лосли їх піймання, показали високий відсоток антитіл до H3N2, починаючи з 1968 р. (O'Brien, Tauraso, 1973). Повідомлення Murphy і со-авт. (1972) теж було цікавим: вони описали спалах, викликану вірусом, подібним А/Гонконг/68 у мавп мар-мозет з Колумбії, яка почалася до прибуття партії мавп в лабораторію. Ці дані показують, що вірус грипу А людини. Може викликати спалахи у мавп в певних умовах, але висока частота передачі інфекції, можливо, властива тільки вірусу Гонконг.

  Г. ПРОТЯГОМ ХВОРОБИ В УМОВАХ ПРИДУШЕННЯ ІМУНІТЕТУ

  Впливу на системи імунітету у заражених грипом тварин можуть представляти інтерес в аспекті підвищення чутливості до інфекції у експериментальних тварин і придбання чутливості у несприйнятливих господарів. Однак повідомлень про такі дослідженнях трохи і опубліковані дані суперечливі. Повідомлялося (Singer et al., 1972), що у мишей, підданих дії циклофосфаміду, зменшувалася тяжкість захворювання, викликаного вірусом A/PR8. Навпаки, Virelizier і співавт. (1974) знайшли, що миші, що отримали циклофосфамід, набагато чутливіші до летального дії A/PR8, ніж, нормальні лінії: титр препарату вірусу в LD50 був принаймні

  в 100 разів вище у. мишей, оброблених циклофосфамідом '. Mayer і співавт. (1973) теж виявили, що іммуносунпрес-ся, викликана циклофосфамідом, підсилює нейровірулент-ність вірусу A / NWS. Результати цих двох робіт дозволяють вважати, що гуморальні антитіла є важливим фактором у видужанні мишей при грипозної інфекції. Миші з подовженою вилочкової залозою були дещо дошкульніше до вірусу PR8, ніж нормальні миші (Virelizier et al., 1974). Дослідження на курях з віддаленої Фабрі-ціевий сумкою показали (Portnoy et al., 1973), що у них підвищувалася чутливість до зараження ВЧП; це розглядалося як вказівка ??на роль гуморальних антитіл в одужанні від цієї інфекції.

  IV. ВИДІЛЕННЯ ВІРУСУ

  Проби для виділення вірусу слід брати не пізніше ніж через 3 дні після початку захворювання. Ймовірність виділення вірусу швидко знижується після цього терміну, але в деяких випадках вірус можна виділити на 7-й і навіть 10-й день хвороби. Найкраще вірус виділяється з носових змивів. Однак мазки, узяті з глотки і носа, 'більш зручні для лікаря і менш неприємні для хворого. Проби, призначені для виділення вірусу, слід постійно тримати на холоді і якомога швидше використовувати. Якщо не можна інокулювати їх протягом 48 год після взяття, слід помістити проби в закритий посудину і. Зберігати в сухому льоду або в рефрижераторі при -70 ° С. У летальні випадки при підозрі на грипозну пневмонію слід намагатися виділити вірус з тканини легенів, слизової трахеї, а також крові. У цих випадках виділення вірусу здійснювалося з перемінним успіхом (iDowdle, Coleman, 1974).

  Віруси грипу А і В розмножуються в курячих ембріонах і у ряду лабораторних тварин. Курячі ембріони і культури клітин точок макак резусів і зеленої мавпи вважаються найбільш чутливими для виділення вірусу. Вірус грипу типу С виділяли лише на курячих ембріонах.

  Для максимально успішного виділення вірусів слід заражати 10-11-денні ембріони одночасно в порожнині амніону і аллантоиса. Ембріони інкубують при 33 ° С 3 - 4 дні і проби амніотичної і аллантоісной рідини перевіряють на наявність вірусу, додаючи еритроцити курей або морських свинок. Еритроцити морської свинки (або групи крові 0 людини) вважаються більш чутливими, ніж курячі, для виявлення вірусів H0N1 і H1N1 на ранніх пасажах в курячому ембріоні. Це не відноситься до вірусів,

  поширеним в-даний час: вони-однаково агглютинируют і ті й інші еритроцити. Курячі еритроцити мають деякі переваги: ??швидше осідають, ніж еритроцити (ссавців, титри гемаглютинації їх легше враховуються і вони менш 'схильні неспецифічної аглютинації сироватками ссавців. У деяких випадках необхідні два або три «сліпих» амниотических ІАС-сажа, перш ніж вірус досягає титру, достатнього для гемаглютинації. Якщо вірус розмножується або легко адаптується до розмноження при інокуляції в іолость аллан-тоіса, амніотічеекіе пасажі не потрібні.

  Для виділення вірусу грипу типу С 7-денні курячі ембріони заражають в порожнину амніону і інкубують при 33 ° С 5 днів. У порожнині аллантоиса вірус погано накопичується навіть після (численних пасажів на ембріонах.

  Клітини нирок зелених мавп або макак резусів в мо-нослой'ной культурі в пробірках є найбільш чутливою культуральної системою для виділення вірусів грипу А і В. Неопеціфіческое (придушення вірусів речовинами, що містяться в сироватках в культуральному середовищі, є серйозною проблемою; моношар слід кілька разів промити середовищем без сироватки і використовувати таке середовище для підтримки культури після зараження. Віруси грипу А гірше ростуть в культурах клітин, ніж віруси грипу В. цитопатичної ефект проявляється у вигляді накопичення вакуолізуються клітин, які потім дегенерують або відокремлюються від скла. цитопатичної ефект проявляється у вигляді накопичення вакуолізуються клітин, які потім дегенерують або відокремлюються від скла. цитопатичної ефект слабовиражени, непатогнамонічен, може не виявлятися при перших пасса'жах. Присутність вірусу зазвичай встановлюється гемадсорбції еритроцитів морської свинки (Vogel, Shelokov, 1957) протягом 3-4 днів після зараження , задовго до розвитку вираженого цитопатического ефекту.

  Більшість виділених штамів вірусу грипу типу В може бути виявлено гемадсорбції або тим агглютинацией протягом 3-4 днів після зараження. Цитопатичної ефект зазвичай теж помітний. Клітини стають зернистими, набухають, округлюються; пізніше розвиваються пікноз і фрагментація, шар клітин зрештою руйнується. Розвиток цітолатічесшго дії, і накопичення (гемагглютининов можуть бути прискорені для вірусів А і В, якщо помістити пробірки в обертовий барабан, хоча ймовірність виділення вірусу від цього не збільшується.

  Слід одночасно культивувати незаражені культури клітин в пробірках, щоб виключити можливість випадкової контамінації вірусами. Вірус парагрипу типу 2 (SV5), що викликає гемадсорбції, є нерідким кон-

  тамінантом в культурах нирок макак резусів. Неспецифічна адсорбція старих еритроцитів характерна для більшості культур ниркових клітин і може бути помилково прийнята за вказівку на присутність вірусу (Dowdle, Robinson, 1966), тому для гемадсорбції повинні використовуватися тільки свіжі еритроцити. Більшість культур клітин нирки макак резусів містить віруси типів SV40 і SV13 («пеня» вірус). Хоча присутність цих агентів небажано і може перешкодити інтерпретації цитопатического ефекту, вони не впливають, 'мабуть, на чутливість клітин - до вірусів грипу при їх виділенні.

  Важко оцінити кількісно ефективність виділення вірусів грипу А і В у культурі тканини і на ембріонах. Велика кількість виділюваних штамів обох вірусів сильно варіює по роках. Взагалі кажучи, культура клітин нирок мавп має перевагу при виділенні вірусів В, але ступінь цього (переваги варіює. Вірус А ще більш вариабелен і для нього курячі ембріони дошкульніше клітинних культур. | З цієї причини, а також у зв'язку зі значною біологічної (як і антигенної) мінливістю вірусів грипу не завжди можна сказати заздалегідь, який метод виділення виявиться більш ефективним. Зараження первинних культур нирок макак резусів або зелених мавп одночасно із зараженням курячих ембріонів в порожнину аллан-. тоіса і амніону рекомендується для виділення максимальної кількості штамів вірусів грипу А і 'В.



  ЛІТЕРАТУРА

  Albrecht P., Blaskovic D., Styk В., Roller M. Acta virol. (Prague), 1963

  Andrewes С. Н., Laidlaw P. P., Smith W. Lancet, 1934, v. 2, p. 859. Barber W. H., Small P. A. Infect. Immunity, 1974, v. 9, p. 530. Basarab O., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1969, v. 50, p. 612. Basarab 0., Smith H. Brit. J. exp. Path., 1970, v. 51, p. 1. Baskerville A., Thomas G., Wood M., Harris W. J. Brit. J. exp. Path., 1974, v. 55, p. 130.

  Beare A. S., Keast K. A. J. gen. Virol., 1974, v. 22, p. 347

  Becht І. J. gen. Virol, 1969, v. 4, p. 215.

  Berendt R. F. Infec. Immunity, 1974,

  Bernkoff H. Proc. Soc. exp. Biol., 1949, v. 72, p. 680. Boveridge W. I. В., Burnet F. M. Med. res. Counc. (Gt. Brit.). Spec. Rep. Ser.,

  J946, v. 256. Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972

  Blaskovic P., Rhodes A. J., Labzoffsky N. A. Arch. ges. Virusforsch., 1972b,

  Bd 39, S. 299.

  Burnet F. M. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1940, v. 18, p. 353. Burnet F. M., Bull D. «. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1943, v. 21, p. 55. Came P. E., Pascale A., Shimonaski G. Arch. ges. Virusforsch., 1968, Bd 23 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Культивування вірусів грипу людини в лабораторних умовах, коло господарів серед лабораторних тварин і виділення вірусу з клінічного матеріалу"
  1.  Кільбурн Е.Д.. Віруси грипу та грип (1978), 1978
      культивуванню, біохімії і особливостям молекулярного пристрою. Зміст: Віруси грипу та грип. Структура вірусу грипу. Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін. Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу. РНК вірусів грипу. Генетика вірусу грипу. Реплікація вірусу грипу.
  2. А
      культивуванні в анаеробних умовах на м'ясному, декстрозних 1% ном агарі, кров'яному, сироватковому МПА, гліцериновому агарі при t 37 {{?}} C ??через 1-2 тижні з'являються білі, а потім світло-коричневі колонії. На полужидкой середовищі колонії мають жовтувато-білий колір, округлу форму. У мазках з 10-15 денних культур видно діфтероідние типу грампозитивні палички, які можуть розташовуватися у вигляді
  3. В
      культивування мікроба при підвищеній температурі, рентгенівське і ультрафіолетове опромінення, пассирование збудника через тварин певного виду, дія бактеріофага та антибіотиків. Посилення В. досягається пасажем через особливо чутливі види тварин, шляхом асоціації з іншими мікробами та ін Закріплення В. на певному рівні (одержання стандартних вакцин, цінних штамів
  4. Г
      культивування яєць нематодов, виділених із фекалій заражених тварин; посмертно Г. встановлюють на підставі виявлення великої кількості (тисячі екз.) нематодов. Лікування. Вівцям одноразово, перорально з подрібненим зерном дають (на 1 кг маси тіла): нілверм - 0,02 г; фенотіазін - 0,5 г; нафтамон - 0,9-0,5 г; тіабендазол - 0,075 р. Заходи боротьби. У неблагополучних господарствах проводять
  5. К
      культивування інвазійних личинок, виділених із фекалій заражених тварин; посмертно - виявленням коопер в тонких кишках, сичузі або підшлунковій залозі. Лікування. Ефективні нілверм, тіабендазол і фенбендазол відповідно в дозах (на 1 кг маси тіла): 0,015 г; 0,100 г; 0,0075 р. Профілактика не розроблена. + + + Копростаз (Coprostasis), застій вмісту в товстих кишках.
  6. М
      культивування інвазійних личинок, виділених із фекалій заражених тварин. Личинки мають характерний головний кінець. Лікування: фенотіазін в дозі 0,15 г на 1 кг маси тіла. Профілактика не розроблена. Mecistocirrus digitatus: 1 - головний кінець; 2 - хвостова бурса самця; 3 - хвостовий кінець самки; 4 - личинка 3 й стадії; 5 - головний кінець личинки 3 й стадії. + + + Мешотчатий
  7. Н
      культивування застосовують різні рідкі та щільні живильні середовища, до складу яких входять продукти гідролізу тканин (перевар Хоттингера та ін.) У замороженому стані збудник зберігає життєздатність до 50 діб, при висушуванні гине через 1-3 сут, при нагріванні до t 60 {{°}} C - через 30 хв, до t 100 {{°}} C - через 1 хв. Мікроб руйнується в розчині перманганату калію (1: 100)
  8. Р
      культивування мікробів ємністю від 50 до 2000 л (мал.). Бактерійних культуру в Р. б. вирощують при t 37 {{?}} C, постійної аерації (анаероби вирощують без аерації), періодичному додаванні 40% ного розчину глюкози, не допускаючи закислення середовища. Термін вирощування залежить від виду мікроба, наприклад, для анаеробів - 5-7 год, бактерій правця - 6-7 сут. Мікробіологічний реактор, використовуваний
  9.  Віруси грипу та грип
      культивуванні найпростіших і після того, як метацікліческі змінена трипаносома пройде цикл розвитку в переноснику відбувається повернення до вихідного антигенною типу (Vickerman, 1969). Таким чином, антигенні генотипи, мабуть, виникають не за рахунок мутації та селекції подібно до вірусів грипу. Таким же чином зміна поверхневих антигенів мерозоїти при експериментальній малярії у
  10.  Еволюція
      вірусів, чисельність яких в ньому воістину колосальна і які в силу цього контролюють розвиток планктону і мікроорганізмів. Так чи інакше, але еволюція біль шинства відомих вірусів в першу чергу нерозривно пов'язана з еволюцією наземних організмів, на яких вони паразитують ють, причому багато хто вважає, що цим і пояснюється різноманітність вірусов14. Віруси не залишили слідів у
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...