Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
ГоловнаМедицинаОнкологія
« Попередня Наступна »
Петренко А.А. Аналіз метилування ДНК при раку шийки матки, 2003 - перейти до змісту підручника

Клонування продуктів ПЛР

Вектор.

Для клонування продуктів ПЛР ми використовували плазміду pGEM ®-T Easy, що входить до складу системи pGEM ®-T Easy Vector System ("Promega", США). Так як деякі термостабільні ДНК-полімерази, зокрема Taq ДНК-полімераза, часто додають на 3 'кінець амліфіката одиночний дезоксиаденозин, то вектор pGEM ®-T Easy містить в сайті клонування на обох 3' кінцях исскустве доданий одиночний кінцевий тимідин. Ця модифікація дозволяє значно збільшити ефективність лигирования продукту ПЛР та плазміди, оскільки забезпечує компліментарність решт продукту ПЛР та плазміди і знижує ймовірність самолігірованія вектора. Відбір трансформованих клонів вели по їх резистентності до ампіциліну, забезпечуваною вектором pGEM ®-T Easy, і за допомогою біохімічного тесту, іменованого біло-блакитний селекцією. Несучі рекомбінантні плазміди бактерії утворюють колонії білого кольору, а бактеріальні клони, що містять тільки плазміду, - блакитного. Полілінкерамі фланкируют промотори T7 і SP6 РНК полімераз, що дозволяє проводити визначення нуклеотидної послідовності вставки, використовуючи відповідні праймери.

Лигирование фрагмента ДНК, отриманого в результаті ПЛР, з вектором pGEM ®-T Easy проводили за методикою, запропонованої фірмою. Трансформацію компетентних клітин проводили всім кількістю отриманої рекомбінантної плазміди.

Отримання компетентних клітин Escherichia coli.

Для отримання компетентних клітин ми використовували штам XL1-Blue Escherichia coli і стандартний метод із застосуванням CaCl2 і RbCl (під ред. Гловера 1988).

У 500 мл колбу вносили 50 мл середовища SOС і 1 мл нічної культури бактерій. Нарощували клітини при 37оС з інтенсивним перемішуванням до щільності -5-10 клітина / мл, що для даного штаму відповідає оптичної щільності D550=0.5. Після досягнення бактеріальними клітинами необхідної концентрації переносили культуру в поліпропіленові пробірки і охолоджували в крижаній бані протягом 15 хв.
Потім облягали клітини центрифугуванням при 3 тис. об / хв протягом 15 хв при 4оС і ретельно видаляли супернатант. Далі ресуспендіровалі клітини в обсязі буфера RF1, що становить 1/3 від зібраного обсягу, і інкубували клітини в крижаній бані протягом 15 хв. Облягали клітини як описано вище. Потім ресуспендіровалі клітини в буфері RF2 (1/12.5 початкового об'єму) і інкубували у крижаній бані протягом 15 хв. Після цього суспензію клітин розділяли на аліквоти по 100 мкл в охолоджені 1.5 мл мікроцентріфужние пробірки і швидко заморожували в рідкому азоті. Компетентні клітини зберігали при температурі-70оС.

Трансформація клітин Escherichia coli.

100 мкл суспензії компетентних клітин розморожували у крижаній бані, вносили рекомбінантний ДНК, обережно перемішували і залишали у крижаній бані протягом 30 хв. Потім клітини витримували у водяній бані при 42 ° С протягом 90 сек (фаза "теплового шоку") і швидко охолоджували у крижаній бані протягом 10 хв. Потім до суспензії клітин додавали 400 мкл середовища SOC і інкубували при 37оС протягом однієї години для розвитку стійкості до селективного антибіотика. Потім клітини висаджували на чашки Петрі з 3.5% тріптоз-агаром ("Ferak", Німеччина), що містить антибіотик ампицилин в концентрації 75 мкг / мл, IPTG (0.8 мг на поверхню 60 мм чашки) і X-gal (0.8 мг на поверхню 60 мм чашки). Після цього клітини інкубували протягом ночі при 37оС. Бактеріальні клони, що несуть рекомбінантні плазміди, відбирали методом біло-блакитний селекції. Відібрані клони висівали в 4 мл середовища LB, містить ампицилин в концентрації 50 мкг / мл, інкубували при 37оС протягом ночі і виділяли з бактеріальних клітин рекомбінантні плазміди.

Виділення плазмідної ДНК.

Аналітичні кількості плазмідної ДНК виділяли двома способами:

Перший спосіб являє собою метод лужного лізису нічної культури бактерій (Маніатіс з співавт.
, 1988). Після осадження бактерій з 4 мл середовища LB центрифугированием протягом 1 хв осад ресуспендували струшуванням в 300 мкл охолодженого в льоду розчину 1 для виділення плазмід і інкубували протягом 5 хв при кімнатній температурі. Потім додавали 600 мкл свіжоприготованого розчину 2 (лізуючого) і обережно перемішували вміст, перевертаючи пробірку 4-5 разів без струшування. Витримували в крижаній бані протягом 5 хв. Далі додавали 450 мкл охолодженого в льоду розчину 3 (нейтралізуючого) і обережно перемішували вміст, перевертаючи пробірку 4-5 разів без струшування. Інкубували у крижаній бані протягом 5 хв. Після цього центрифугували при 13 тис. об / хв протягом 5 хв при 4оС. Переносили супернатант і додавали до неї рівний об'єм суміші фенол-хлороформ. Перемішували протягом 2 хв інтенсивним струшуванням і центрифугували протягом 2 хв. Потім до супернатанту додавали рівний об'єм хлороформу і повторювали процедуру. Далі облягали ДНК двома об'ємами етанолу, витримавши протягом 5 хв при кімнатній температурі, і центрифугували при 13 тис. об / хв протягом 10 хв при 4оС. Осад промивали 75% етанолом на 1 STE, висушували у вакуумному ексикаторі, розчиняли в 50 мкл буфера ТЕ і обробляли РНКази 20 мкг / мл.

Другий спосіб являє собою використання системи для виділення плазмід Wizard ® Plus SV Minipreps DNA Purification System ("Promega", США). Виділення проводили по протоколу, запропонованого фірмою.

Кількісну оцінку плазмідної ДНК здійснювали спектрофотометрично. Сиквенс клонованого продукту ПЛР у складі вектора проводився на автоматичному сіквенаторе в інституті Молекулярної біології ім. Енгельгардта, Росія.
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
Інформація, релевантна " Клонування продуктів ПЛР "
  1. Пошук CpG-острівців, гіперметілірованних в пухлинах шийки матки
    Принцип методу метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами. Завданням нашого дослідження було виявлення CpG-острівців, метильованих в пухлинах шийки матки. Для її вирішення ми використовували метод метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами (СП-ПЛР) (Gonsalgo et al. 1997). Принцип методу полягає в наступному. ДНК з двох порівнюваних зразків (в
  2. ВСТУП У клінічної імунології
    Бартон Ф. Хайнес, Антон С. Фаучи (Barton F. Haynes, Anthony S. Fauci) Фундаментальні дослідження в галузі імунології сприяли більшим успіхам багатьох клінічних дисциплін, таких як алергологія, ревматологія, неврологія та кардіологія. Застосування моноклональних антитіл привело до революційних перетворень в галузі досліджень поверхневих антигенів ефекторних і
  3. ГОЛОВНИЙ КОМПЛЕКС ГЕНОВ гістосумісності
    Чарлз Б. Карпентер (Charles В. Carpenter) Антигени, що забезпечують внутрішньовидові відмінності особин, позначаються як аллоантігени, а коли вони включаються в процес відторгнення алогенних тканинних трансплантатів, то набувають назву антигенів тканинної сумісності (гістосумісності). Еволюція закріпила одиничний ділянку тісно зчеплених генів гістосумісності, продукти яких на
  4. ОСНОВИ ПРОТИПУХЛИННОЇ ТЕРАПІЇ
    Вінсент Т. де Віта (Vincent Т. De Vita, JR.) Біологія пухлинного росту Основи протипухлинної терапії базуються на наших знаннях про біології пухлинного росту. Два десятиліття тому уявлення про те, що навіть невеликі за розмірами первинні ракові пухлини відривають життєздатні пухлинні клітини в систему циркуляції і ці клітини здатні рости так само, як і в первинній
  5. стафілококової інфекції
    Річард M. Локслі (Richard M. Locksley) Стафілококи, з яких золотистий стафілокок відноситься до найбільш важливих патогенних агентів для людини, являють собою стійкі грампозитивні бактерії, що мешкають на шкірних покривах. При порушенні цілісності шкірних покривів або слизових оболонок під час операції або в результаті травми стафілококи можуть потрапляти в підлеглі тканини і
  6. ВРОДЖЕНІ ПОРУШЕННЯ ОБМІНУ АМІНОКИСЛОТ
    Леон Е. Розенберг (Leon Е. Rosenberg) Всі поліпептиди і білки є полімери 20 різних амінокислот. Вісім з них, звані незамінними, не синтезуються в організмі людини, тому їх необхідно вводити з харчовими продуктами. Решта утворюються ендогенно. Незважаючи на те що більша частина які в організмі амінокислот пов'язана в білках, все ж всередині клітини
  7. лізосомної ХВОРОБИ НАКОПИЧЕННЯ
    Артур Л. Боде (Arthur L. Beaudet) Загальні ознаки Визначення. Лізосоми являють собою цитоплазматичні органели , в кислому середовищі яких містяться численні ферменти, гидролизующие більшість біологічних макромолекул (рис. 316-1). Первинні лізосоми являють собою особливі тільця, які утворюються з пластичного комплексу (апарат Гольджі). Вони можуть зливатися з
  8. ЯДЕРНА ПЕРЕСАДЖУВАННЯ соматичних клітин СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКИХ ТВАРИН І непарнокопитних
    Стаття 4.11.1. Введення На першому засіданні Ad hoc групи з біотехнології (3-5 квітня 2006) Комісія з біологічним нормам запропонувала обмежити її мандат розробкою « рекомендацій про ризики для здоров'я тварин при клонуванні шляхом ядерної пересадки соматичних клітин (TNCS) сільськогосподарських тварин і непарнокопитних, в тому числі про критерії оцінки здоров'я ембріонів і
  9. Генна інженерія
    Генна інженерія Генна інженерія - розділ біотехнології, пов'язаний з цілеспрямованим конструюванням in vitro нових комбінацій генетичного матеріалу, здатного розмножуватися в клітці і синтезувати певний продукт. Генна інженерія вирішує наступні завдання: 1) отримання генів шляхом їх синтезу або виділення з клітин; 2) отримання рекомбінантних молекул ДНК; 3)
© medbib.in.ua - Медична Бібліотека