Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
ГоловнаМедицинаІмунологія та алергологія
« Попередня Наступна »
Адельман Д .. Імунологія, 1993 - перейти до змісту підручника

Якісні та кількісні методи визначення IgA, IgG і IgM.

Імуноглобуліни - це глікопротеїди, секретуються плазматичними клітинами. Вироблення антитіл відбувається, як правило, після антигенної стимуляції. Більшість антигенів викликають одночасну стимуляцію декількох клонів B-лімфоцитів - поліклональна стимуляція. Антитіла, що виробляються одним клоном B-лімфоцитів, - моноклональні антитіла - повністю ідентичні. Між антитілами, які виробляються різними клонами B-лімфоцитів, завжди є які-небудь відмінності, наприклад в будові ділянки зв'язування з антигеном або силі зв'язування з антигеном. Відомі 5 класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. В основі будови молекули імуноглобуліну будь-якого класу лежить Y-подібна структура, що складається з 2 важких і 2 легких ланцюгів, з'єднаних дисульфідними містками (див. гл. 1, п. IV.А.4). «Гілки» молекули (Fab-фрагмент) служать для зв'язування антигену, а «стовбур» (Fc-фрагмент) виконує інші біологічні функції: активує комплемент, зв'язується з клітинною мембраною і т. д. IgG присутні в біологічних рідинах у вигляді мономерів. Вони становлять більшу частину імуноглобулінів сироватки і є основним класом імуноглобулінів, що виробляються при вторинному імунній відповіді. IgE, також мономірні, беруть участь в алергічних реакціях негайного типу. IgD знаходяться в основному на мембранах B-лімфоцитів і виконують роль антігенраспознающіх рецепторів, в сироватці присутні в незначній кількості у вигляді мономерів. IgA містяться в сироватці переважно у вигляді мономерів, в секреті слизових і молозиві - у вигляді димерів, що містять також J-ланцюг і секреторний компонент, який синтезується в епітелії слизових. Дімерная IgA з'єднується з секреторним компонентом, проходячи через епітелій на поверхню слизової. IgM присутні в сироватці переважно у вигляді пентамер. Вони складають основну частку імуноглобулінів, що виробляються при первинному імунній відповіді. Методи дослідження імуноглобулінів включають в себе визначення рівня імуноглобулінів різних класів і підкласів та антитіл до певних антигенів. При оцінці результатів дослідження необхідно враховувати, що рівень імуноглобулінів залежить від віку (див. додатки IV і V). Зміна рівня імуноглобулінів у сироватці може бути наслідком порушення їх синтезу, катаболізму або виведення.

А. Електрофорез

1. Зональний електрофорез - Напівкількісний метод, що дозволяє розділити суміш білків в залежності від їх молекулярної маси та електричного заряду. Суть методу полягає в наступному: досліджувану суміш білків на носії (наприклад, пластині з гелем) поміщають в камеру для електрофорезу, заповнену буферним розчином і підключену до джерела постійного струму. При електрофорезі білків сироватки зазвичай виходить 5 основних смуг, які відповідають фракціям альбуміну, альфа 1-, альфа2-, бета-і гамма-глобулінів (див. рис. 20.1). Імуноглобуліни мігрують переважно у фракцію гамма-глобулінів, хоча також присутні у фракціях бета-і альфа2-глобулінів. Відносний вміст кожної фракції сироваткових білків можна оцінити за допомогою денситометра. За допомогою зонального електрофорезу можна досліджувати не тільки сироватку, а й інші біологічні рідини, наприклад СМЖ і сечу. Цей метод дозволяє оцінити білковий склад досліджуваної проби і виявити моноклональні антитіла, хоча він недостатньо чутливий для визначення моноклональних антитіл в низькій концентрації на ранніх стадіях мієломної хвороби.

2. Іммуноелектрофорез. Суть методу полягає в наступному: 1) проводять електрофоретичної поділ білків в гелі; 2) після закінчення електрофорезу в гелі паралельно напрямку електрофорезу вирізують борозенки, 3) в борозенки вносять антитіла (антисироватки), наприклад до тяжких (альфа, дельта, епсилон, гама, мю) або легким (лямбда, каппа) ланцюгах імуноглобулінів. Ці антитіла і розділення при електрофорезі білки дифундують назустріч один одному. У тих місцях, де антитіла зв'язуються з білками, утворюються дуги преципітації (див. рис. 20.2). Іммуноелектрофорез дозволяє оцінити лише якісний склад досліджуваної суміші білків. Оцінка результатів дослідження вимагає високої кваліфікації. Найчастіше цей метод застосовується для виявлення і характеристики моноклональних антитіл.

3. Електрофорез з іммунофіксаціей. Цей метод заснований на електрофоретичному поділі білків сироватки в гелі з наступною інкубацією гелю в присутності антитіл до важких і легких ланцюгів імуноглобулінів.
При зв'язуванні білків з антитілами утворюються імунні комплекси, які можна побачити після фарбування (див. рис. 20.3). Імунні комплекси, що містять нормальні імуноглобуліни, відкладаються у вигляді широкої, розмитою смуги, моноклональні - у вигляді вужчої і чітко окресленої. Цей метод також є якісним, однак більш чутливий і простий, ніж іммуноелектрофорез. Електрофорез з іммунофіксаціей часто застосовується в поєднанні з іммуноелектрофореза для визначення моноклональних або олігоклональних імуноглобулінів.

Б. Подвійна радіальна іммунодіффузія - Напівкількісний метод, за допомогою якого можна не тільки виявити антигени, але й оцінити ступінь подібності між ними. Суть методу полягає в наступному: 1) у лунки, вирізані в агарі, вносять досліджувану суміш антигенів і антитіла з відомою специфічністю (зазвичай в центральну лунку вносять антитіла, а в розташовані навколо неї - антигени), 2) антигени і антитіла дифундують у напрямку один до одного; 3) в тому місці, де сталося зв'язування антитіл і антигенів, утворюються смуги преципітації. За взаємною розташуванню і формі смуг преципітації можна оцінити ступінь подібності між антигенами, що знаходяться в сусідніх лунках. В даний час цей метод застосовується в діагностиці аутоімунних захворювань для виявлення аутоантитіл до екстрагованих ядерних антигенів (див. гл. 15, п. II.Д.2). Хоча по чутливості метод подвійної радіальної імунодифузії поступається багатьом кількісним методам, технічно він простий, не вимагає високоочищених антитіл, специфічний і може використовуватися при проведенні масових досліджень.

В. Проста радіальна іммунодіффузія дозволяє кількісно визначити вміст антигену в досліджуваній пробі. Суть методу полягає в наступному. У шарі агару, що містить антитіла, вирізують лунки, в одні з яких вносять досліджуваний антиген, в інші - стандартний. Антигени дифундують з лунок в агар, утворюючи радіальні зони преципітації. Діаметр зони преципітації пропорційний концентрації антигену. Це простий і надійний метод кількісної оцінки імуноглобулінів (включаючи підкласи IgG), компонентів комплементу (наприклад, C3, C4, фактора B) та інших білків сироватки. Існують готові набори, що дозволяють визначити антиген в низькій концентрації - не більше 3 мкг / мл. Визначаючи вміст імуноглобулінів, необхідно враховувати, що зміна їх властивостей може спотворювати результати дослідження. Так, якщо в сироватці містяться мономерні IgM (наприклад, при макроглобулінемії Вальденстрема, атаксії-телеангіектазії), рівень IgM буде штучно завищений, оскільки мономерний IgM дифундує швидше, ніж пентамерний. Присутність ревматоїдного фактора в досліджуваній пробі, навпаки, штучно знижує рівень IgG, оскільки імунні комплекси, які з IgG і ревматоїдного фактора, дифундують повільніше, ніж непов'язаний IgG. Сироватка багатьох хворих з дефіцитом IgA містить антитіла до білків тваринного походження, наприклад до козячим імуноглобулінам, тому при використанні козячих антитіл для визначення рівня IgA в цьому випадку виходять завищені результати.

Г. Нефелометрія - визначення концентрації зважених часток і високомолекулярних речовин в розчині, засноване на оцінці інтенсивності розсіювання світла, що проходить через цей розчин. Нефелометрія може бути використана для визначення концентрації антигенів, оскільки при додаванні до них антитіл утворюються імунні комплекси, що розсіюють проходить світло. Нефелометрія дозволяє з високою точністю визначити концентрацію IgG, IgA, IgM, підкласів IgG, C3, C4, фактора B, C-реактивного білка і деяких інших сироваткових білків. Цей метод підходить для визначення білків у низькій концентрації, наприклад IgE, рівень якого в сироватці не перевищує 1 мкг / мл. В даний час багато лабораторії використовують нефелометрії в якості стандартного методу кількісного визначення імуноглобулінів.

Д. РІА. Цей високочутливий метод розроблений більше 30 років тому і спочатку використовувався для визначення концентрації інсуліну та інших гормонів. Зараз він використовується і для визначення антигенів і антитіл. Існує кілька модифікацій методу. Одна з них заснована на конкурентному зв'язуванні меченного радіоактивним ізотопом і немічених антигену з антитілами. Суть методу полягає в наступному: 1) відоме кількість антитіл змішують з відомою кількістю міченого антигену і досліджуваної пробою (яка містить невідому кількість антигену), 2) антиген, що міститься в пробі, і стандартний мічений антиген зв'язуються з антитілами, 3) чим вищий вміст немічених антигену , тим менше міченого антигену зв'яжеться з антитілами (див.
рис. 20.4). Концентрацію антигену в досліджуваній пробі оцінюють за рівнем радіоактивності імунних комплексів. Той же підхід може бути використаний для визначення концентрації антитіл в пробі. У цьому випадку відоме кількість антигену змішують з відомою кількістю стандартних мічених антитіл і досліджуваної пробою (яка містить невідому кількість антитіл). Інша модифікація методу заснована на іммобілізації антигену або антитіла на твердій підкладці (див. гл. 20, п. I.Е). Основні недоліки методу - необхідність дорогого обладнання та реактивів, а також умов для роботи з радіоактивними ізотопами.

Е. Твердофазний ІФА. Як твердої фази найчастіше використовуються полістиролових планшети з сорбованих на них антигенами або антитілами. Визначення антитіл до якого-небудь антигену проводять таким чином: 1) досліджувану рідину вносять в лунки планшета з сорбованих на них антигеном; 2) під час інкубації антитіла зв'язуються з антигеном; 3) планшет відмивають від несвязавшихся антитіл і додають антитіла до імуноглобулінів (друга антитіла ), мічені ферментом; 4) планшет знову відмивають, додають субстрат ферменту і хромоген (речовина, що міняє забарвлення в процесі хімічної реакції); 5) під дією продукту ферментативної реакції хромоген змінює забарвлення. Чим більше мічених ферментом другий антитіл зв'язується з комплексами антиген-антитіло, тим вище активність ферменту і інтенсивність забарвлення розчину (див. рис. 20.5). Концентрацію антитіл в пробі визначають спектрофотометрично - по оптичної щільності пофарбованого розчину. Такий же підхід застосовується для визначення антигену в пробі. У цьому випадку використовуються планшети з сорбованих антитілами до досліджуваного антигену, мічені ферментом другого антитіла також спрямовані до цього антигену (див. рис. 20.5). Твердофазних ІФА застосовують для кількісної оцінки антитіл і антигенів. За чутливості він порівнянний з РІА, але більш простий, дешевий і не вимагає застосування радіоактивних ізотопів. Багато лабораторії використовують твердофазний ІФА в якості стандартного методу визначення противірусних антитіл, включаючи антитіла до ВІЛ, цитокінів та імуноглобулінів (IgE і підкласів IgG).

Ж. Імуноблотинг - якісний метод, що дозволяє виявляти антигени і антитіла в досліджуваній пробі. Антитіла за допомогою цього методу виявляють наступним чином: 1) суміш відомих антигенів розділяють з допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі і переносять на нітроцелюлозну мембрану; 2) мембрану інкубують з досліджуваної пробою, наприклад сироваткою, а потім - з міченими антитілами до імуноглобулінів. Для виявлення антигенів електрофоретичного розділення піддаються білки досліджуваної проби, які потім переносяться на мембрану з наступним додаванням мічених антитіл до відомих антигенів. В даний час випускаються готові набори для проведення иммуноблоттинга. Цей метод широко застосовується для підтвердження результатів твердофазного ІФА при діагностиці ВІЛ-інфекції.

З. Інші методи дослідження

1. Непряма імунофлюоресценція - метод, за допомогою якого можна виявити антитіла до відомих антигенів. Як джерело антигену зазвичай використовують зрізи тканин або культури клітин. Субстрат, перенесений на предметне скло, інкубують у присутності досліджуваної проби, наприклад сироватки, а потім - у присутності мічених флюорохромом антитіл до імуноглобулінів. Пов'язані з субстратом антитіла виявляють за допомогою флуоресцентного мікроскопа. Цей метод зазвичай застосовується для виявлення антинуклеарних антитіл і антитіл до деяких вірусів. Хоча метод не є кількісним, він досить чутливий і простий.

2. Методи, засновані на реакції аглютинації. Для реакції аглютинації зазвичай використовують еритроцити (гемагглютинация) або частинки латексу (латекс-аглютинація), покриті відомим антигеном. У присутності антитіл до цього антигену відбувається аглютинація еритроцитів або частинок латексу. Гемаглютинація застосовується для виявлення антитіл до тиреоглобуліну і мікросомальним антигенів, латекс-аглютинація - для виявлення ревматоїдного фактора і деяких інших антитіл. Ці методи прості і дозволяють кількісно визначити антиген, проте менш чутливі, ніж РИА і твердофазних ІФА.
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Якісні та кількісні методи визначення IgA, IgG і IgM."
  1.  ОРГАНІЗАЦІЯ РОБОТИ ЖІНОЧОЇ КОНСУЛЬТАЦІЇ Диспансерне спостереження ВАГІТНИХ
      Жіноча консультація (ЖК) є підрозділом поліклініки, МСЧ або пологового будинку, надають амбулаторну лікувально-профілактичну, акушерсько-гінекологічну допомогу населенню. Основними завданнями жіночої консультації є: надання кваліфікованої акушерсько-гінекологічної допомоги населенню прикріпленої території; проведення лікувально-профілактичних заходів,
  2.  Гнійно-запальні післяпологові ЗАХВОРЮВАННЯ
      Післяпологові інфекційні захворювання - захворювання, які спостерігаються у породіль, безпосередньо пов'язані з вагітністю та пологами і обумовлені бактеріальною інфекцією. Інфекційні захворювання, виявлені в післяпологовому періоді, але патогенетично не зв'язані з вагітністю та пологами (грип, дізентірея та ін), до групи післяпологових захворювань не відносять. ЕТІОЛОГІЯ І ПАТОГЕНЕЗ
  3.  Тема: бактеріологія, мікології, протозоологов
      Систематика і номенклатура мікроорганізмів. Об'єкти вивчення мікробіології. Прокаріоти (бактерії), їх відмінність від мікробів еукаріотів (найпростіші, гриби) за структурою, хімічним складом, функції. Сучасні підходи до систематики мікроорганізмів. Таксономічні категорії: царство, відділ, сімейство, рід, вид. Внутрішньовидові категорії: біовар, серовар, фаговар, морфовар, культивар.
  4.  МЕДИЧНА ІМУНОЛОГІЯ
      Тема: Імунологія як наука про способи і механізми захисту від генетично чужорідних речовин з метою підтримання гомеостазу організму Виникнення і становлення імунології як науки, етапи формування імунології. Роль вітчизняних та зарубіжних вчених у розвитку імунології, нобелівські лауреати в галузі імунології. Основні напрямки сучасної імунології: клітинна, молекулярна,
  5.  40.ІНСТРУМЕНТАЛЬНИЕ І ЛАБОРАТОРНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ СИСТЕМИ сечовиділення. ДІАГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ.
      Спеціальні, в тому числі інструментальні, методи дослідження підкріплюють дані загальноклінічного обстеження хворого і дозволяють насамперед виявити приховано протікають форми хвороб нирок, а також оцінювати ступінь активності процесу, анатомічні особливості (розмір), що важливо знати при тривало існуючому захворюванні, асиметрію розмірів і форми нирок, які можуть бути обумовлені
  6.  Нейрогуморальна регуляція і стан репродуктивної системи в період її активного функціонування
      Останнє двадцятиріччя відзначено значними досягненнями в аналізі механізмів ендокринного контролю менструального циклу жінки. Численні клінічні та експериментальні дослідження дали можливість істотно розширити уявлення про основні закономірності процесів росту фолікула, овуляції і розвитку жовтого тіла, охарактеризувати особливості гонадотропной і гіпоталамічної
  7.  Ювенільні маткові кровотечі
      Визначення поняття. До ювенільний маткових кровотеч (ЮМК) відносяться ациклічні кровотечі, які виникають в період статевого дозрівання. ЮМК нерідко називають дісфунк-287 Глава 3. Патологія репродуктивної системи в період її становлення ми Іраку матковими кровотечами, рідше - пубертатними або підліткових. Частота. ЮМК - одна з найбільш частих форм порушення
  8.  Лейоміома матки
      Визначення поняття. Лейоміома матки (ЛМ) - одна з найбільш часто зустрічаються доброякісних пухлин репродуктивної системи жінки. Пухлина має мезенхімального походження і утворюється з мезенхіми статевого горбка, навколишнього зачатки Мюллерова проток (рис. 4.8). Мезенхіма є попередником примітивного міобласти, індиферентних клітин строми ендометрію і різних клітинних
  9.  Остеопороз
      Визначення поняття. Особливе місце серед патологічних станів, що супроводжують вікове вимикання функції репродуктивної системи, належить порушень в кістковій системі. Клінічно це виражається в зниженні щільності кісток внаслідок зменшення їх маси або недостатнього звапніння. Це явище носить назву остеопорозу. Інтерес численних дослідників і лікарів до проблеми
  10.  Якість життя гінекологічних хворих
      В останні роки в медичній літературі все частіше вживається такий термін, як «якість життя». Відповідно до визначення ВООЗ (1976), здоров'я характеризується «станом повного фізичного, психічного і соціального благополуччя, а не тільки відсутність хвороб або фізичних дефектів». Якість же життя, за загальноприйнятим визначенням, представляє собою інтегральну характеристику
© medbib.in.ua - Медична Бібліотека