Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
ГоловнаМедицинаОнкологія
« Попередня Наступна »
Петренко А.А. Аналіз метилування ДНК при раку шийки матки, 2003 - перейти до змісту підручника

Дослідження експресії і статусу метилювання гена Р3А-адаптіна при раку шийки матки

Після встановлення повного розміру CpG -острівця гена вза-адаптіна ми провели дослідження взаємозв'язку між метилированием цього CpG-острівця і транскрипцією асоційованого з ним гена. Як відомо, метилирование CpG-острівця зазвичай супроводжується інактивацією транскрипції (див. розділ "Метилирование ДНК"). Тому завданнями нашого дослідження на даному етапі були вивчення рівня експресії мРНК гена вза-адаптіна і підтвердження статусу метилювання CpG-острівця гена вза-адаптіна в пухлинах шийки матки і в клітинних лініях раку шийки матки.

Дослідження експресії мРНК гена вза-адаптіна в пухлинах шийки матки і в клітинних лініях раку шийки матки.

Зміна рівня експресії мРНК гена вза-адаптіна ми вивчали з використанням двох методів: блот-гібридизації РНК і ампліфікації кДНК, отриманої зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР). При гібридизації в якості зонда до гену вза-адаптіну ми використовували продукт ПЛР, що включає в себе послідовність перших екзона гена. Амплификацию кДНК проводили з використанням праймерів, розташованих в першому і в другому екзонах гена вза-адаптіна, розділених Інтроном, послідовність якого становить 26 856 п.н.

Вивчення рівня мРНК вза-адаптіна в зразках норми і пухлини шийки матки ми проводили на препаратах тотальної РНК. Всього за допомогою блот-гібридизації ми досліджували п'ятнадцять випадків раку шийки матки. І тільки в одному зразку (номер 289) ми виявили помітне зниження кількості мРНК вза-адаптіна в пухлині в порівнянні з нормою (рис. 16А). Невелика частота зниження рівня мРНК гена вза-адаптіна в пухлинах в порівнянні з нормою може бути пов'язана з тим, що, з одного боку, це дійсно рідкісна подія, а з іншого - з убіквітарное експресією гена (Dell'Angelica et al. 1997) і присутністю у зразках

пухлини і норми стромальних елементів (фібробластів, клітин крові і кровоносних судин) і можливої ??контамінацією нормальними клітинами пухлини і навпаки.



Малюнок 16. Аналіз експресії мРНК гена вза-адаптіна. А. Рівень мРНК у зразку раку шийки матки. Верхній ряд - результат гібридизації тотальної РНК радіоактівномеченним зондом до першого екзонах гена. Нижній ряд - фотографія агарозного гелю з тотальною РНК після електрофорезу. Н - РНК з нормального епітелію; О - РНК з пухлини шийки матки однієї і тієї ж хворий. Числами праворуч вказано розташування рибосомальних РНК (28S і 18S). Б. Рівень мРНК в клітинних лініях HeLa і SiHa до і після обробки 5-азацітідіном (5-azaC). Результат електрофорезу в агарозному гелі продуктів ОТ-ПЛР.

У зв'язку з цим, ми досліджували зміна кількості мРНК гена вза-адаптіна в клітинних лініях раку шийки матки HeLa і SiHa після обробки їх деметилюється агентом 5-азацітідіном за допомогою ОТ-ПЛР і блот-гібридизації. 5-азацітідін є інгібітором ДНК-метилтрансферази 1, яка здійснює в клітці підтримують метилирование. При її інактивації, відбувається реплікативного-залежне деметилювання ДНК, включаючи і аберантно-метиловані CpG острівці. До недавнього часу було загальновизнано, що таким способом можливо домогтися відновлення експресії мРНК гена, якщо вона придушується за рахунок метилювання ДНК. Порівняння рівня мРНК ми проводили у необроблених і оброблених клітинах однієї і тієї ж культури. Результати типового досвіду, отримані при застосуванні ОТ-ПЛР, представлені на малюнку 16Б. Видно, що в клітинах HeLa після обробки 5-азацітідіном відбувається реактивація транскрипції гена вЗАадаптіна. У клітинах SiHa збільшення рівня мРНК відбувалося в два рази. Дослідження методом Нозерн-блоттинга підтвердило ці результати (дані не представлені). Таким чином, ми встановили, що при обробці клітин раку шийки матки HeLa і SiHa деметилюється агентом відбувається реактивація експресії гена / ЗА-адаптіна. На підставі цих дослідів можна зробити висновок про те, що експресія мРНК / ЗА-адаптіна істотно знижена, принаймні, в клітинах HeLa і може бути активована деметилюється агентом. 2.2. Вивчення статусу метилювання CpG-острівця гена / ЗА-адаптіна в пухлинах шийки матки і в клітинних лініях раку шийки матки.

Щоб з'ясувати, як пов'язана транскрипція гена / ЗА-адаптіна з метилированием, ми досліджували статус CpG динуклеотидів, що входять до складу його CpG-острівця, в клітинних лініях HeLa і SiHa. Для цього ми використовували метил-чутливий ПЛР зі специфічними праймерами (МЧ-ПЛР), гібридизацію по Саузерну і визначення нуклеотидної послідовності бісульфітний-модифікованої ДНК. Як і у випадку СП-ПЛР перші два методи подразумевают обробку ДНК метілчувствітельнимі ферментами. При цьому досліджуються CpG динуклеотид, що входять до складу сайтів рестрикції МЧР. Найбільше число сайтів рестрикції в складі CpG острівця гена / ЗА-адаптіна спостерігається для ферментів HpaII (10) і HhaI (8). Статус метилування сайтів рестриктаз HhaI і SacII ми вивчали за допомогою МЧ-ПЛР, рестріктази HpaII - блот-гібридизацією.

Розташування сайтів рестрикції ферменту HhaI і використаних в роботі праймерів представлено на малюнку 17А. У разі застосування праймерів 26-13 і 26-8, ми визначали статус метилювання CpG динуклеотидів у складі семи сайтів. Результат цього дослідження представлений на малюнку 17Б. Відсутність продуктів ПЛР при ампліфікації ДНК, обробленої рестриктазою HhaI, говорить про те, що хоча б в одному з досліджених сайтів рестрикції CpG динуклеотид не береться під

метилированию. Дроблення первісної зони досліджень на більш короткі відрізки з меншим числом сайтів рестрикції (використовували комбінацію праймерів 26-14 і 26-8; 26-1 і 26-3) і, таким чином, зменшення числа досліджуваних за один раз CpG динуклеотидів ситуацію не змінило. Ми завжди спостерігали відсутність продукту ПЛР, тобто сайти рестріктази Hhal виявлялися рестріцірованнимі. Таким чином, при дослідженні статусу метилювання сайтів рестрикції ферменту Hhal в межах CpG-острівця гена вза-адаптіна ми встановили, що CpG дінуклетіди, що входять до складу цих сайтів не метиловані в клітинних лініях HeLa і SiHa.



Малюнок 17. Аналіз статусу метилювання CpG динуклеотидів, що входять до складу сайтів рестрикції метілчувствітельного ферменту Hhal в межах CpG-острівця гена вза-адаптіна, за допомогою МЧ-ПЛР. А. Схематичне зображення розташування сайтів рестрикції ферменту Hhal (вертикальна риса). Стрілками позначені використані праймери;? - CpG острівець, І - 1 екзон. Б. Результат електрофорезу в агарозному гелі продуктів ампліфікації ДНК із клітинних ліній за допомогою праймерів 26-13 і 26-8. Рестрикція зразків ДНК Hhal (Hh) або без рестрикції (-). М - маркер 100 bp. Числами справа вказані розміри маркерних фрагментів.

Для вивчення статус метилювання CpG динуклеотидів в сайтах рестріктази HpaII ми використовували метод гібридизації ДНК по Саузерну. Тут ми обробляли ДНК із клітинних ліній метілчувствітельной рестриктазою HpaII і, додатково, ферментом рестрикції Mspl, який є ізошізомером HpaII, але не чутливий до критичного для рестріктази HpaII метилированию. При цьому ми додатково досліджували

ДНК з клітин культур HeLa і SiHa, оброблених 5-азацітідіном. Зонд для гібридизації представляв собою продукт ПЛР, який ми отримали за допомогою ампліфікації геномної ДНК з праймерами 26-1 і 26-3. На малюнку 18А представлено розташування сайтів рестрикції HpaII / MspI в досліджуваному регіоні гена і набір варіантів продуктів гібридизації,

А.



Малюнок 18.

Аналіз статусу метилювання CpG динуклеотидів

, що входять до складу сайтів рестрикції метілчувствітельного ферменту HpaII в межах CpG острівця гена вза-адаптіна, за допомогою гібридизації по Саузерну. А. Схематичне зображення розташування сайтів рестрикції (вертикальна риса) стосовно CpG острівця-I |. Горизонтальними лініями позначені варіанти продуктів гібридизації. Число праворуч позначає розмір продукту. І - 1 екзон. Б. Результат гібридизації культур клітин раку шийки матки до і після обробки 5-азацітідіном. Числами вверху малюнка позначені: 1 - Hela, 2 - Hela +5 azaC, 3 - Siha, 4 - Siha +5 azaC. Рестрикція зразків ДНК HpaII (H) або MspI (M). Числами зліва вказані розміри маркерних фрагментів.

Які будуть спостерігатися при тому чи іншому розподілі метилування сайтів рестріктази HpaII. Рестрикція ферментом MspI є контролем, так як при цьому утворюється єдиний продукт мінімального розміру 444 н.п. Результат гібридизації ДНК із клітинних культур представлений на малюнку 18Б. Видно, що в клітинах HeLa при рестрикції як HpaII, так і MspI спостерігається один і той же продукт (відзначений товстою стрілкою), що говорить про відсутність метилування сайтів HpaII в цих клітинах. У разі клітинної лінії SiHa можливе часткове метилування одного-двох CpG динуклеотидів, так як при рестрикції ДНК ферментом HpaII відзначається додаткова смуга більшого розміру, ніж основний продукт (відзначений тонкої стрілкою). Таким чином, при вивченні статусу метилювання CpG динуклеотидів у складі сайтів рестрикції ферменту HpaII ми встановили, що в клітинних лініях HeLa і SiHa більшість CpG динуклеотидів НЕ метилірованої.

CpG-острівець гена вза-адаптіна ми виявили за допомогою СП-ПЛР по метилированию сайтів рестріктази SacII. Тому представлялося можливим, що транскрипція гена вза-адаптіна регулюється метилированием сайту будь-якого специфічного транскрипційного фактора, що містить сайт рестріктази SacII. У послідовності CpG-острівця гена вза-адаптіна присутні два сайти рестрикції цього ферменту, позначені нами як сайт 1 (S1) і сайт 2 (S2, рис. 19А). Для дослідження статусу метилування цих сайтів ми використовували праймери 26-14 і 26-8 (S1), 26-1 і 26-3 (S2); рестрикцию ДНК ферментом SacII проводили дворазово. Результати ампліфікації представлені на малюнку 19Б. У двох клітинних лініях при вивченні статусу метилювання сайту 1 ми спостерігали присутність продукту ПЛР, а при дослідженні статусу метилювання сайту 2 продукт ПЛР був відсутній в тих же зразках ДНК.
Однак, при дослідженні статусу метилювання сайту 1 рестріктази SacII в зразках норми і пухлини шийки матки (амплификацию проводили із застосуванням праймерів 26-7 і 26-8) з'ясувалося, що в шести з восьми зразків продукт ПЛР був присутній не тільки в пухлині, але і в нормі. Приклад такого дослідження представлений на малюнку 19В. У теж час у разі сайту 2 продукту ПЛР для більшості цих зразків не було ні в нормі, ні в пухлини. Такий результат може бути пов'язаний з одного боку з метилированием цього рестрикційного сайту не тільки в пухлині, а й в нормальній тканині, а з іншого боку з тим, що даний сайт є труднорестріціруемим.



Малюнок 19. Аналіз статусу метилювання CpG динуклеотидів, що входять до складу сайтів рестрикції метілчувствітельного ферменту SacII в межах CpG острівця гена вза-адаптіна методом МЧ-ПЛР. А. Схематичне зображення розташування сайтів рестрикції ферменту SacII (вертикальна риса). Стрілками позначені використані праймери;? - CpG острівець, І - 1 екзон. Б. і В. Результат електрофорезу в агарозному гелі продуктів ампліфікації ДНК із клітинних ліній (Б) і із зразків норми і пухлини шийки матки (В). Рестрикція зразків ДНК SacII (S) або без рестрикції (-). М-маркер 100 bp. Числами вгорі вказані номери зразків, де Н - ДНК з нормальної тканини, О - ДНК з пухлини шийки матки; числами праворуч - розміри маркерних фрагментів.

У зв'язку з цим ми використовували бісульфітний сиквенс ДНК, який дозволяє точно встановити статус метилювання кожного CpG динуклеотид, і не обмежений рамками сайтів рестрикції. При обробці ДНК бісульфітом натрію в молекулі цитозину відбувається заміщення атома водню на Гідросульфітні групу по вуглецю в шостому положенні. Ця модифікація призводить до різкого зростання швидкості дезаминирования і до перетворення після десульфонаціі залишку цитозину в залишок урацила. 5-метілцітозін таким перетворенням не береться під. Тому, після ампліфікації обробленої ДНК в продукті ПЛР відбувається заміна неметілірованного залишку цитозину на залишок тиміну, в той час як метилований залишок цитозину залишається самим собою, тобто залишком цитозину. Дослідження статусу метилювання CpG-острівця гена вза-адаптіна таким способом ми проводили в клітинній лінії HeLa і в зразках пухлини 286 і 289 (модифікована бісульфітом натрію ДНК була люб'язно надана співробітником лабораторії молекулярної біології вірусів Іванової Т.А.). Амплификацию ми проводили полугнездовим способом за допомогою трьох праймерів, підібраних до модифікованої ДНК. На малюнку 20 схематично представлена ??досліджувана зона, а також наведені хроматограми сиквенса ділянки CpG-острівця довжиною 86 н.п. в клітинах HeLa і в зразку пухлини 289 і немодифіковані нуклеотидних послідовність цієї ж ділянки. Видно, що в обох випадках у всіх шести наведених CpG динуклеотид залишок цитозину виявився зміщенням на тимін, тобто був неметілірованним. Наведений малюнку сайт рестріктази SacII являє собою перший з двох розташованих у межах CpG-острівця сайтів рестрикції цього ферменту (сайт S1). За результатами застосування МЧ-ПЛР даний сайт мав метилований статус. Тут же обидва CpG динуклеотид, що входять до складу сайту, знаходяться в неметілірованном стані. Таким чином, ми зіткнулися з труднорестріціруемим сайтом рестріктази SacII.



Узагальнені результати, які ми отримали при вивченні статусу метилювання ділянки CpG-острівця гена | З3А-адаптіна розміром 411 н.п. за допомогою бісульфітного сиквенса, виглядають наступним чином. У всіх трьох випадках ми досліджували 26 CpG динуклеотидів. У клітинах лінії HeLa неметілірованний статус мали 21 CpG динуклеотид. У зразку пухлини 286 неметілірованное число CpG динуклеотидів склало 23, у зразку 289 неметілірованнимі були 24 CpG динуклеотид. При цьому слід зауважити, що, на противагу неметілірованним CpG динуклеотид, статус метилювання інших досліджених CpG динуклеотидів однозначно визначити було неможливо, так як хроматографічна картина сиквенса цих CpG динуклеотидів і оточуючих їх районів не мала достатньої чіткості і ясності. Виходячи з результатів, отриманих нами трьома різними методами, можна зробити висновок, що CpG-острівець гена | З3А-адаптіна не береться під істотного метилированию в клітинних лініях раку шийки матки і в плоскоклітинних карциномах шийки матки.

  Таким чином, з одного боку експресію мРНК гена | З3А-адаптіна можна реактивировать деметилюється агентом в клітинних лініях раку шийки матки, а з іншого боку CpG-острівець самого гена не береться під аберрантним метилированию в цих же клітинних лініях. Ці дані дозволяють зробити висновок про те, що експресія мРНК | З3А-адаптіна пригнічена в клітинах HeLa і SiHa, і в одній з 15 пухлин шийки матки, але це придушення експресії не пов'язане з метилированием дослідженого району CpG-острівця гена | З3А-адаптіна.

  Обговорення результатів

  CpG-острівці є структурно-функціональними елементами геному. Як вже зазначалося нами раніше, вони переважно розташовуються на 5 'кінцях генів в області нетранскрібіруемих послідовностей промоторів, першого екзонів і інтронів і, за деякими винятками (імпринтинг, інактивована Х хромосома), що не метиловані в нормальній клітині. Зроблений у роботі пошук CpG-острівців із зміненим статусом метилування в пухлинних клітинах в порівнянні з нормальними дозволив отримати результати, які можуть бути розглянуті в двох аспектах. Представляється цікавим оцінити, по-перше, можливість використання методу метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами для виявлення послідовностей, що володіють властивостями CpG-острівців, по-друге, здатність методу диференціювати метиловані і неметілірованние CpG-острівці.

  За допомогою використаного методу було виявлено 7 GC-багатих фрагментів ДНК довжиною від 300 до 1200 пар основ, п'ять з яких (більше двох третин) мають властивості CpG-острівців. З п'яти виявлених CpG-острівців два виявилися неподання в опублікованих версіях генома людини: CpG-острівець 26 був представлений неповністю (відсутня область, фланкирующей 5 'кінець гена вза-адаптіна), CpG-острівець 22 до цих пір відсутня в опублікованих базах даних. Відсутність CpG-острівців в банках відомих послідовностей пов'язано, мабуть, з труднощами секвенування GC-багатих фрагментів ДНК стандартними методами, а також з тим обставиною, що CpG-острівці з високою частотою зустрічаються в гарячих точках рекомбінації, внаслідок чого можуть втрачатися при клонуванні (Kong et al. 2002). Це може бути пов'язано також з використанням NotI-клонотекі для побудови великомасштабних фізичних карт геному людини. Останнім часом було виявлено, що при створенні таких клонотекі втрачаються відносно короткі фрагменти, що містять кластери сайтів впізнавання крупнощепящей рестріктази NotI, про існування яких раніше не було відомо (Домнінська та ін 1999). Втрачені фрагменти з великою ймовірністю містять CpG-острівці, оскільки з розрахунків близько 90% сайтів впізнавання NotI повинні розташовуватися в CpG-острівцях (Lindsay and Bird 1987). Таким чином, використаний у роботі метод скринінгу GC-багатих послідовностей дозволяє ефективно виявляти CpG-острівці, в тому числі і неподання в банках відомих послідовностей генома, і може бути корисний для заповнення "білих плям" в геномі людини.

  Для оцінки здатності використаного методу ідентифікувати диференційно-метелірованние CpG-острівці необхідний аналіз їх статусу метилювання в клітинних лініях і первинних пухлинах шийки матки в порівнянні з нормальними тканинами. Такий аналіз проведено для двох CpG-острівців: CpG-острівця 32, локалізованого на 13 хромосомі, і CpG-острівця 26, асоційованого з геном вза-адаптіна.

  Для CpG-острівця 32 метиловані аллели були виявлені в лейкоцитах периферичної крові носіїв пухлини, в більшості пухлин шийки матки і нормальних тканин, прилеглих до пухлини. Однак в 1 з 22 пухлин шийки матки спостерігалася відсутність метилування цього району. Таким чином, CpG-острівець 32 дійсно різна метилірованої в деяких пухлинах і нормальних тканинах. Виявлений характер метилування CpG-острівця 32 (присутність метильованих алелей в нормальних тканинах) робить його цілком можливим кандидатом на роль CpG-острівця, пов'язаного з імпринтовані локусом на хромосомі 13q34, і вказує на необхідність його подальшого дослідження.

  При підтвердженні статусу метилювання CpG-острівця, асоційованого з геном вза-адаптіна (фрагмент 26), було виявлено розбіжність між результатами методів, заснованих на застосуванні метілчувствітельних рестриктаз і прямим визначенням метілцітозіна шляхом бісульфітного секвенування. У даному випадку мала місце стійкість одного з сайтів впізнавання метілчувствітельного ферменту SacII до дії ферменту, незважаючи на відсутність метилування цитозину в ньому. Стійкість до гідролізу цього сайту SacII була підтверджена на великому числі зразків ДНК і спостерігалася паралельно з повним гідролізом іншого сайту SacII, розташованого в межах цього CpG-острівця. Мабуть, така відносна стійкість пов'язана з особливостями структури ДНК в GC-багатих районах, фланкуючих цей сайт. Так як скринінг диференційно-метильованих фрагментів ДНК методом метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами заснований на використанні метілчувствітельних рестриктаз, необхідно брати до уваги можливість неповної рестрикції, пов'язаної з особливостями структури GC-багатих районів. Таким чином, відбір диференційно-метильованих CpG-острівців даним методом можливий, але в поєднанні з додатковим ретельним аналізом статусу метилювання ідентифікованих CpG-острівців, що включає великий набір метілчувствітельних рестриктаз, а також методи, засновані на прямому визначенні 5-метілцітозіна у послідовності. Можливість успішного скринінгу цим методом змін метилювання, асоційованих з канцерогенезом, було також продемонстровано іншими авторами (Kohno et al.
 1998; Liang et al. 2000).

  З 5 ідентифікованих нами CpG-острівців тільки один (CpG-острівець 26) мав часткову гомологію з 5 'кінцем відомого гена вза-адаптіна і був детально нами досліджений. У результаті клонування, визначення нуклеотидної послідовності повнорозмірного CpG-острівця гена вза-адаптіна, аналізу його статусу метилювання та експресії був виявлений наступний феномен. З одного боку, було виявлено придушення експресії мРНК вза-адаптіна в одній з пухлин і в двох клітинних лініях раку шийки матки. При цьому експресія мРНК вза-адаптіна може бути активована в клітинних лініях обробкою деметилюється агентом 5-азацітідіном. З іншого боку, аналіз статусу метилювання CpG-острівця гена вза-адаптіна з використанням метілчувствітельних рестриктаз і прямим визначенням 5-метілцітозіна секвенуванням ДНК, обробленої бісульфітом натрію, виявив відсутність істотного метилування в клітинних лініях, первинних пухлинах шийки матки і лейкоцитах периферичної крові в районі промотора і першого екзона. Ген вза-адаптіна являє собою не єдиний приклад такого роду. Феномен непрямий активації експресії гена (у відсутність метилювання CpG-острівця гена) в результаті обробки пухлинних клітин деметилюється агентами 5-азацітідіном і 5-аза-2'-дезоксіцітідіном був описаний для генів Apaf-1 (Soengas et al. 2001), TIMP- 2 (Cappabianca et al. 2003), TGF-p (Shin et al. 1992) і TGF-ВЯП (Ammanamanchi et al. 1998). У трьох останніх випадках було показано, що активація експресії мРНК цих генів відбувалася внаслідок активації транскрипційних факторів Sp1 і NF-Y.

  Відновлення транскрипції генів, в тому числі і вза-адаптіна, під дією деметилюється агентів може бути пов'язане з двома механізмами їх дії. По-перше, ці агенти викликають деметилювання ДНК, інгібуючи ферментативное метилирование цитозинових залишків у знову синтезованої ланцюга ДНК. Це призводить до дефіциту 5-метілцітозінових залишків по всьому геному оброблених клітин. Цілком можливо, що в результаті цього процесу відбувається деметилювання та активація експресії регулятора транскрипції вза-адаптіна, який був инактивирован метилированием в пухлинної клітці, що й було причиною придушення транскрипції вза-адаптіна. Цілком можливо, що вза-адаптін опосередковано інактивується в результаті абберантних метилування інших районів ДНК в пухлинних клітинах.

  По-друге, нещодавно було показано, що 5-аза-2'-дезоксіцітідін, незалежно від його деметилюється дії на ДНК, володіє також здатністю пригнічувати лізин-специфічне метилирование гістонів і індукувати швидку деконденсація гетерохроматина (Takebayashi et al. 2001; Nguyen et al . 2002; Kondo and Issa 2003). Присутність гистона Н3, метилованого по лізину в положенні 9, є характерною рисою гетерохроматина і спостерігається на інактивованої Х хромосомі, в репресивному хроматині під час розвитку і в районі генів, аберантно-нетранскрібіруемих при канцерогенезі (Boggs et al. 2002; Peters et al. 2002 ; Nguyen et al. 2002). Не можна виключити, що викликається 5-аза-2'-дезоксіцітідіном деметилювання лізину 9 гистона Н3 і супроводжує його ремоделирование гетерохроматина може за наявності відповідних транскрипційних факторів в оброблюваних клітинах активувати транскрипцію генів, інактивація яких не пов'язана з метилированием їх промоторів.

  Придушення транскрипції гена вза-адаптіна в пухлинних клітинах раніше не було описано. Питання про частоту цієї події в первинних пухлинах шийки матки вимагає подальшого дослідження методами, що дозволяють виключити взаємну контамінацію пухлинних і нормальних клітин, що важливо через убіквітарное характеру експресії гена (ОТ-ПЛР in situ, імуногістохімія, мікродіссекціонние препарати

  РНК).

  Залишається відкритим питання про те, які селективні переваги може забезпечити пухлинної клітці придушення експресії однієї з субодиниць комплексу АР3.

  Білок p3A-адаптін являє собою велику субодиницю гетеротетрамерного адаптерного білкового комплексу АР-3. Ген, продуктом якого є | З3A-адаптін, локалізований на хромосомі 5 в зоні 5q14.1 і експресується у всіх досліджених тканинах (Dell'Angelica et al. 1997). Всього у ссавців описано чотири таких комплекси: АР-1, АР-2, АР-3 і АР-4 (див. огляд Boehm and Bonifacino 2001). Кожен з комплексів складається з 4 субодиниць: двох великих адаптінов (один з y / a / S / s і (31-4, відповідно), одного середнього адаптіна (Ц1-4) і одного малого адаптіна (о 1-4). Також як і | 33A-адаптін, білки адаптерних комплексів експресуються у всіх клітинах ссавців. Аналогічні субодиниці всіх чотирьох комплексів гомологични один одному і мають схожу доменну організацію, що передбачає і функціональне схожість. Вони локалізовані на мембранах органел, які здійснюють екзо / ендоцитоз. АР комплекси приймають участь в утворенні транспортних везикул, у впізнавання переносите білків і в залученні їх у транспортні везикули. Так АР-2, мабуть, локалізується виключно на плазматичній мембрані і здійснює швидкий ендоцитоз активованих мембранних рецепторів. АР-1, АР-3 і АР- 4, в свою чергу, розташовуються на мембранах внутрішньоклітинних компарментов, таких як транс-мережу апарату Гольджі і ендосоми. Проте дані про виняткову локалізації | 33A-адаптіна тільки в цій частині апарата Гольджи суперечливі (див. огляд Boehm and Bonifacino 2002). Комплекс АР -3 бере участь у транспорті білків до лізосом і спорідненим їм органеллам. У ссавців сюди входять меланосоми і щільні тільця тромбоцитів (див. огляд Boehm and Bonifacino 2002). АР-1, АР-3 і АР-4 комплекси взаємодіють з цитозольними доменами трансмембранних білків , проте, механізми такої взаємодії і його взаємозв'язок зі специфічним подією, складовим сортування білків, поки не зрозумілі. Показано, що зв'язування з сигналами сортування в транспортуються білках можуть виконувати fi і (3 субодиниці (див. огляд Robinson and Bonifacino 2001). Так, (3 субодиниця дізнається ділейціновий сигнал в амінокислотної послідовності білка-мішені (Rapoport et al.

  1998).

  Природні мутації S і (3 субодиниць адаптерного комплексу АР3 у мишей призводять до гипопигментации волосяного покриву і очей, тривалим кровотеч і порушень в структурі лізосом (див. огляд Boehm and Bonifacino 2002). Такі фенотипічні прояви є відображенням дефектів біогенезу меланосом, щільних тілець тромбоцитів і лізосом, відповідно. У людини також виявлені мутації гена вза-адаптіна при синдромі Hermansky-Pudlak другого типу (HPS-2). Подібно мутантним мишам, у людей з цим синдромом спостерігається гіпопігментація очей і шкіри, тривалі кровотечі і порушення в структурі лізосом. Як в мутантних мишачих клітинах, так і в клітинах від хворих HPS-2 виявлений помилковий транспорт білків лізосомальної мембрани CD63 і lamp-1 через цитоплазматичну мембрану. Можливо, що спостережувані дефекти в АР-3-дефецітних клітинах реалізуються саме через неправильні сортування транспортні ряду трансмембранних білків у відповідні органели. Хоча ген вза-адаптіна експресується убіквітарное, тобто у всіх тканинах дорослого організму, його мутації призводять до фенотипическим проявам тільки в меланоцитах і тромбоцитах. Можливо, що в цих клітинах комплекс АР-3 має якісь специфічні функції на додаток до функцій, виконуваних у всіх інших клітинах.

  Останнім часом з'явилися свідчення того, що білки везикулярного транспорту залучені в канцерогенез (див. огляд Floyd and De Camilli 1998). Описано транслокації трьох генів, продукти яких беруть участь у ендоцитозі (AF1-p, EEN і CALM), при різних формах лейкозів. Однак, точні функції продуктів цих генів в ендоцитозі поки невідомі. Амфіфізіни I і II беруть участь у формуванні клатріна-асоційованих везикул. Амфіфізін I гіперекспрессірован при раку молочної залози. Амфіфізін II зв'язується з протоонкогенах c-Abl і підсилює його трансформує здатність.

  Одним з можливих пояснень ролі порушень експресії білків везикулярного транспорту в канцерогенезі може бути що виникає внаслідок цього порушення експресії різних рецепторів на поверхні клітин. На користь такої точки зору говорять наступні експериментальні факти. Показано, що клітини, які експресують рецептор епідермального фактора росту (EGFR), нездатний піддаватися інтерналізації, володіють підвищеним проліферативним відповіддю на дію EGF (Vieira at al. 1996). Також продемонстровано, що продукт гена Nef вірусу імунодефіциту людини першого типу (HIV-1) здатний індукувати швидкий ендоцитоз CD4 рецептора з поверхні клітин і направляти його в лізосоми, послідовно взаємодіючи з комплексами двох типів AP і COPI, які беруть участь у везикулярного транспорті (Janvier et al . 2001). Іншими словами, взаємодія Nef з білками везикулярного транспорту призводить до порушення нормального транспорту рецептора CD4 і придушенню його експресії на поверхні клітин. Таким чином, порушення коректного везикулярного транспорту може істотно вплинути на експресію рецепторів на поверхні клітин.

  Нещодавно за допомогою системи подвійних гібридів було виявлено взаємодію продукту одного з ранніх генів HPV-16 білка Е2 з 8-адаптіном. | 33А-адаптін і 8-адаптін - це дві великі субодиниці комплексу АР-3 (Boehm and Bonifacino 2001). Ще не показано існування взаємодії Е2 і 8-адаптіна у фізіологічних умовах в HPV-16-позитивних клітинах пухлин шийки матки. Виявлене нами зниження експресії мРНК вза-адаптіна в HPV-позитивних пухлинах і взаємодія вірусного білка Е2 з 8-адаптіном вказують на необхідність дослідження порушень везикулярного транспорту в пухлинах шийки матки.

  Брак знань про функції комплексу АР-3 не дозволяє поки однозначно відповісти на питання про те, які наслідки для пухлинної клітини може мати придушення експресії однієї з його субодиниць - (33А-адаптіна. 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Дослідження експресії і статусу метилювання гена Р3А-адаптіна при раку шийки матки "
  1.  Пошук CpG-острівців, гіперметілірованних в пухлинах шийки матки
      Принцип методу метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами. Завданням нашого дослідження було виявлення CpG-острівців, метильованих в пухлинах шийки матки. Для її вирішення ми використовували метод метілчувствітельной ПЛР із статистичними GC-багатими праймерами (СП-ПЛР) (Gonsalgo et al. 1997). Принцип методу полягає в наступному. ДНК з двох порівнюваних зразків (в
  2.  Введення
      Актуальність теми: Рак шийки матки посідає друге місце серед усіх онкологічних захворювань у жінок. Етіологічним фактором раку шийки матки (РШМ) визнані віруси папілом людини (HPV) з так званої групи високого ризику (типи 16, 18 та інші). Після вірусної інфекції РШМ може розвинутися через стадії дисплазії, раку in situ впродовж декількох років, протягом яких у прогресію
  3.  Лейоміома матки
      Визначення поняття. Лейоміома матки (ЛМ) - одна з найбільш часто зустрічаються доброякісних пухлин репродуктивної системи жінки. Пухлина має мезенхімального походження і утворюється з мезенхіми статевого горбка, навколишнього зачатки Мюллерова проток (рис. 4.8). Мезенхіма є попередником примітивного міобласти, індиферентних клітин строми ендометрію і різних клітинних
  4.  ОСНОВИ ПРОТИПУХЛИННОЇ ТЕРАПІЇ
      Вінсент Т. де Віта (Vincent Т. De Vita, JR.) Біологія пухлинного росту Основи протипухлинної терапії базуються на наших знаннях про біології пухлинного росту. Два десятиліття тому уявлення про те, що навіть невеликі за розмірами первинні ракові пухлини відривають життєздатні пухлинні клітини в систему циркуляції і ці клітини здатні рости так само, як і в первинній
  5.  ОСНОВНІ НАПРЯМКИ РАННЬОГО ВИЯВЛЕННЯ ГІНЕКОЛОГІЧНОГО РАКУ
      А.Е. Протасова1, Р.В. Орлова1; 2, Г.А. Раскін2; 3 1Медична академія післядипломної освіти, Санкт-Петербург, 2Городской клінічний онкологічний диспансер, Санкт-Петербург, 3Клініческая лікарня № 122, Санкт-Петербург Федеральна цільова програма Російської Федерації попередження та боротьби з онкологічними захворюваннями до 2020 року передбачає зниження
  6.  Синдром полікістозних яєчників
      Визначення поняття. СПКЯ являє собою клінічний симптомокомплекс, який об'єднує гетерогенні ознаки і симптоми, які свідчать про порушення з боку репродуктивного 389 Глава 4. Патологія репродуктивної системи в період зрілості ної, ендокринної та метаболічної функції організму жінки. Основними клінічними проявами його є оліго-або аменорея і безпліддя на
  7.  ДОБРОЯКІСНІ ЗАХВОРЮВАННЯ МОЛОЧНИХ ЗАЛОЗ
      Остання чверть XX в. характеризувалася зміною структури захворюваності, пов'язаної зі збільшенням тривалості життя (головним чином у розвинених країнах Європи та Америки). На перший план в структурі смертності вийшли серцево-судинні та пухлинні захворювання, частіше зустрічаються у людей старшого віку, пов'язані з обмінними і ендокринними розладами. Особливу заклопотаність у
  8.  II триместр вагітності (період сістемогенеза, або середній плодовий)
      6.3.1. Загальні положення У I триместрі вагітності всі органи плоду і екстраембріональние структури повністю сформовані. З II триместру вагітності починається період інтенсивного росту плода і плаценти, які залежать від МПК і вмісту в крові матері необхідних поживних речовин. Тому харчування матері має важливе значення в попередженні затримки внутрішньоутробного розвитку
  9.  ОСНОВИ неоплазією
      Джон Мендельсон (John Mendelsohn) Вступ. Останні роки позначені значним прогресом у розумінні біологічних і біохімічних основ розвитку раку. Однак це не означає, що проблема неопластичних захворювань вирішена. Успіхи в лікуванні раку у дорослих приходили поступово і стосувалися в основному злоякісних пухлин, що характеризуються незвично високою чутливістю до
  10.  Стафілококової інфекції
      Річард M. Локслі (Richard M. Locksley) Стафілококи, з яких золотистий стафілокок відноситься до найбільш важливих патогенних агентів для людини, являють собою стійкі грампозитивні бактерії, що мешкають на шкірних покривах. При порушенні цілісності шкірних покривів або слизових оболонок під час операції або в результаті травми стафілококи можуть потрапляти в підлеглі тканини і
© medbib.in.ua - Медична Бібліотека