загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Генна інженерія

Генна інженерія

Генна інженерія - розділ біотехнології, пов'язаний з цілеспрямованим конструюванням in vitro нових комбінацій генетичного матеріалу, здатного розмножуватися в клітці і синтезувати певний продукт.

Генна інженерія вирішує наступні завдання:

1) отримання генів шляхом їх синтезу або виділення з клітин;

2) отримання рекомбінантних молекул ДНК;

3) клонування генів або генетичних структур;

4) введення в клітку генів або генетичних структур і синтез чужорідного білка.

Отримання генів. Відомі два способи штучного синтезу генів поза організмом - хімічний та ферментативний. Хімічним шляхом в 1969 р. американський вчений Г. Корану з співр. синтезували ген аланиновой тРНК дріжджів. Цей ген включав 77 пар нуклеотидів, послідовність яких була вже раніше розшифрована. Вчені спочатку синтезували фрагменти ДНК довжиною від 5 до 12 нуклеотидів, потім з'єднали їх у певному порядку за допомогою відкритого до того часу ферменту лігази. Однак ген аланиновой тРНК при введенні в клітину кишкової палички або безклітинну середу не функціонував. Виявилося, що він не мав регуляторних елементів - промотора, де локалізована точка ініціації синтезу, і термінальних кодонів, які дають сигнал про завершення синтезу іРНК. У 1976 р. Г. Корану з співр. здійснили синтез гена супрессорной тирозинового тРНК протяжністю 126 пар нуклеотидів. Були також синтезовані примикають до гену регу-ляторной ділянки: промотор (52 пари нуклеотидів) і термінатор (21 пара нуклеотидів) і прикріплені до кінців полімеру тетрануклеотіди ААТТ і ТТАА. В цьому випадку штучно синтезований ген, вбудований в геном мутантного фага Т4, при введенні в живу кишкову паличку виявився працездатним. У 1979 р. в нашій країні під керівництвом Ю. А. Овчинникова і М. Н. Колосова хімічним шляхом за допомогою ферментів були синтезовані гени гормонів людини і тварин - енкефаліну і брадикініну.

Хіміко-ферментативний синтез досить широко застосовують в генній інженерії для отримання дрібних генів. Для отримання генів тварин, рослин і людини, розмір яких складає 1000-3000 нуклеотидів, цей метод надто складний і поки нездійсненний. Вчені знайшли більш простий спосіб отримання таких генів.

У 1970 р. Г. Темін з співр. виявили фермент зворотну транскриптазу (ревертазу). У 1972 р. було відкрито, що деякі онкогенні віруси за допомогою зворотної транскриптази можуть синтезувати ДНК, використовуючи як матрицю іРНК. Подальші дослідження показали, що матрицями для утворення копій ДНК можуть служити не тільки РНК онкогенних вірусів, але й інші іРНК. Це відкривало принципові можливості ферментативного синтезу будь-яких індивідуальних генів (ДНК), використовуючи їх РНК-копії. Під ферментативним синтезом гена мають на увазі транскрибування комплементарної нитки ДНК (гена) на молекулах РНК в пробірці. Система для синтезу являє собою розчин, в якому містяться всі чотири нуклеотиду, що входять до складу ДНК, іони магнію * фермент зворотна транскриптаза (її отримують з онкогенних вірусів) і матрична (інформаційна) РНК, кодованих геном, копію якого ставиться завдання зняти. На іРНК зворотна транскриптаза синтезує комплементарную їй ланцюг ДНК, а потім на ній за допомогою цього ж ферменту синтезується другий ланцюг ДНК. У результаті виходить ген за структурою такий же, як і той, на якому була синтезована іРНК. Цим способом в лабораторіях багатьох країн створено цілий

ряд генів. У нашій країні під керівництвом В. А. Енгельгардта був розроблений проект «Ревертаза» - програма синтезу генів за допомогою цього ферменту. У здійсненні проекту брали участь провідні вітчизняні та закордонні інституції. У підсумку з 1974 по 1978 р. були синтезовані гени глобіну голуба, кролика і людини, а також гени мітохондрій печінки щурів, частина гена, що кодує імунні білки мишей, та ін

Гени, синтезовані за допомогою зворотної транскриптази, не мають регуляторних ділянок і функціонально неактивні. Тому транскрибування копій ДНК рекомендується проводити з про-мРНК, які мають всі необхідні копії регуляторних частин гена.

Крім викладених способів ген можна отримати шляхом виділення за допомогою трансдуцірующіх фагів.
трусы женские хлопок
Таким шляхом в 1969 р. був вперше виділений лактозного ген кишкової палички. Однак такий спосіб отримання генів не завжди придатний, оскільки передбачає суворі місця локалізації фагів. Тому використовуються й інші прийоми виділення фрагментів ДНК з потрібними для перенесення генами.

Рестріктірующіе ендонуклеази (рестріктази). Важливою подією для розвитку генної інженерії було відкриття в клітинах бактерій ферментів, здатних розрізати молекулу ДНК в суворо визначених місцях. Ферменти ці називаються рестрікті-рующими ендонуклеазами або рестриктазами, а процес «розрізання» молекули ДНК називається рестриктазами. З рестриктазами пов'язані подальші успіхи в молекулярній біології. Вони стали одним з головних елементів генної інженерії. Ділянка ДНК, впізнаваний певної рестриктазою, включає специфічну послідовність з 6-8 пар підстав, є паліндромом. Паліндромом називається послідовність ДНК, яка зчитується однаково в обох напрямках, починаючи від З'-кінця кожного ланцюга. Наприклад, рестриктаза E.coli під назвою EcoRI дізнається послідовність

------ П ААТТ Ц ------

------ Ц ТТАА t Г ------

і, прикріплюючись до неї, робить по одному однонітевую надрізу з обох сторін, тобто розрізає її в симетричних ділянках, зазначених стрілками. В результаті двухцепочная молекула ДНК, якщо була кільцевої, внаслідок розриву набуває лінійну будову. На краях молекули утворюються липкі кінці, представлені однониткових ділянками із чотирьох нуклеотидів: на одному кінці буде послідовність ААТТ, на іншому - ТТАА. При наявності липких кінців молекула ДНК з лінійної форми знову здатна замкнутися в кільце без додаткової обробки. Були виявлені рестріктази, узнающие найрізноманітніші послідовності нуклеотидів. Наприклад, рестриктаза EcoRII дізнається послідовність ЦЦТГГ. До теперішнього часу відомо понад 200 рестриктаз, характерних для різних видів мікроорганізмів. Це відкриває нові можливості для експериментаторів. Величезні молекули вищих організмів включають велике число місць розрізання для ферментів рестрикції. При обробці ДНК рестриктазами утворюються численні фрагменти ДНК, в яких представлені окремі гени. Потім гени можна з'єднувати в певні структури. Залишаються в такій структурі розриви ниток ДНК возз'єднуються лігази. Є і інший спосіб отримання фрагментів ДНК з липкими кінцями. Він полягає в тому, що виділені або штучно синтезовані ділянки ДНК обробляють ендонуклеазою, укорочує ділянки ДНК з обох кінців, після чого за допомогою ферменту полінуклеотідтран-сферази прилаштовують до цих кінців послідовності аден-лових і тіміділових нуклеотидів. Довжина липких полі-А та полі-Т становить 50-100 нуклеотидів. При вбудовуванні гена у вектор використовуються обидва розглянутих методи і часто спільно.

Рекомбінантні ДНК. Рекомбінантна ДНК - це штучно отримана молекула ДНК. Вона має форму кільця, включає ген (гени), що становить об'єкт генетичних маніпуляцій, і так званий вектор, що забезпечує розмноження рекомбінантної ДНК і синтез в клітці господаря певного продукту, кодованого внесеним геном. Векторами є ті компоненти рекомбінантних ДНК, які здатні акцептувати чужорідні гени і забезпечувати їх реплікацію в клітинах господаря. Вектори повинні володіти такими особливостями: 1) мати властивості реплікону; 2) нести субстратні ділянки для рестриктаз, інакше неможлива вмонтовувані ДНК; 3) містити один або кілька маркирующих генів, щоб за фенотипом можна було визначити факт його передачі. Дослідження показали, що ефективними векторами є плазміди. З них в якості векторів використовуються Col El, pSC 101 та ін З вірусів як векторів використовують фаги X, SV 40 і їх похідні. Вектори надають рекомбінантної молекулі здатність відтворюватися незалежно від хромосоми клітини бактерії.

З'єднання вектора з фрагментом ДНК може здійснюватися наступними шляхами: за допомогою липких кінців, що утворюються в ДНК під дією ендонуклеаз рестрикції; додаткового синтезу полінуклеотідних фрагментів кожної з ланцюгів ДНК (полі-А та полі-Т); з'єднання тупих кінців за допомогою Т4-лігази.

На малюнку 25 показані ферментативний синтез гена і вбудовування його в векторну плазміду.
Зліва на іРНК за допомогою зворотної транскриптази синтезується ланцюг ДНК (кДНК), потім іРНК видаляють лугом і за допомогою ДНК-полімерази добудовують другий ланцюг кДНК, екзонуклеаза вкорочують обидві ланцюга ДНК і кінцевий трансферазой пришивають до їх кінців полі-Т-послідовності. На цьому ж малюнку справа показано, що кільцеву ДНК векторної плазміди розрізають рестриктазою і перетворюють її в лінійну форму, потім екзонуклеаза ланцюга вкорочують і кінцевий трансферазой пришивають до них полі-А-послідовності. На останньому етапі з'єднують обидва типи молекул ДНК і отримують гібридну молекулу - векторну плазміду з вбудованим в неї синтезованим геном. Розриви в ланцюгах ДНК возз'єднують лігази.

У даному випадку було відомо, який ген включений у векторну плазміду. Але в роботах по трансгенозу частіше мають справу з багатьма фрагментами ДНК, і серед них тільки одиничні включають ген, який підлягає перенесенню. Для отримання фрагментів ДНК з певним геном застосовують так званий спосіб дробової рушниці, який полягає в тому, що ДНК механічно або ферментами дробиться на безліч дрібних фрагментів, після чого їх наосліп гібрідізіруют з молекулами ДНК вектора. Перед цим ДНК вектора обробляють рестриктазою для додання їм лінійної форми та освіти липких кінців. Після введення рекомбінантних молекул в кишкову паличку за допомогою селективних середовищ виділяють ті бактерії, в які потрапив фрагмент ДНК з потрібним геном. Включений ген виявляють по продукту його дії у вигляді певної речовини (фермент, гормон і т. д.). Розмноження в бактеріях ідентичних рекомбінантних ДНК називається клонуванням.

Кожен клон бактерій містить свою рекомбинантную ДНК.

Розробляються методи, що дозволяють робити заміни

нуклеотидів в ДНК клонованого гена і тим самим змінювати

властивості кодованого цим геном білка.

Введення в клітку рекомбінантних молекул і синтез чужорідного білка. Найчастіше рекомбінантні молекули вводяться в клітини бактерій методом трансформації. Спочатку клітини бактерій з метою підвищення їх здатності поглинати плазмідну ДНК обробляють хлористим кальцієм або хлористим барієм. Після цього в клітинну суспензію вводять розчин з рекомбінантними-ми молекулами. Деякі з цих молекул проникають всередину клітини, і частина з них, прикріпивши до мембран клітини, починає розмножуватися і функціонувати (рис. 26). Одне з найбільш важливих для практики напрямків генної інженерії - конструювання мікроорганізмів-продуцентів потрібних речовин. Першими в цьому напрямку були дослідження К. Ітакура і Г. Боейра з співавт. (1977). Їм вдалося домогтися експресії гена, що кодує гормон соматостатин в клітинах кишкової палички (мал. 27). Потім у різних країнах клітини кишкової палички використовувалися для синтезу ряду білків і гормонів людини і тварин: інсуліну, інтерферонів, гормону росту, урокінази, кальцитоніну, альбуміну, тимозину та ін У лабораторіях А. А. Баєва, Ю. А. Овчинникова, М . Н. Колосова, Е. Д. Свердлова та ін здійснена експресія генів, що кодують енкефалінів, лейкоцитарний інтерферон, брадикінін, сома-тотропін та ін

В останні роки приділяється багато уваги створенню генно-інженерних вакцин. Отримують антигени з рекомбінантних мікроорганізмів або культур клітин, в які введено певний ген збудника хвороби. Цим методом отриманий матеріал для вакцинації проти гепатиту В, грипу А, малярії, ящура, сказу, паравіруса свиней та ін У нашій країні проведена зворотна транскрипція РНК вірусу гепатиту А. ДНК, що кодує вірусний білок гепатиту, була пришита до ДНК вірусу віспи. В результаті ослаблена культура віспи викликає імунітет проти небезпечної хвороби> - гепатиту. Вакцина проходить виробниче випробування.

Штами бактерій, які продукують речовини, активні в організмі людини і тварин, можуть бути використані для промислового виробництва лікарських препаратів.

У нашій країні ведуться роботи з отримання методами генної інженерії суперпродуцентов продуктів, властивих клітинам, таких, як амінокислоти, вітаміни, ферменти, а також щодо створення культур, активно розкладають нафту, пластмаси, руйнують нафталін, фіксуючих азот, і т. д.
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
Інформація, релевантна "Генна інженерія"
  1. МЕДИЧНА ІМУНОЛОГІЯ
    генна інженерія Поняття про біотехнології. Її роль і значення у науково-технічному прогресі. Основні напрямки біотехнології. Роль біотехнології в медицині (створення нових діагностичних, лікувальних і профілактичних препаратів, вирішення проблеми збалансованості харчування, вирішення екологічних проблем). Основні напрямки медичної біотехнології. Основні принципи біотехнології
  2. Передмова
      генна інженерія внесла нові ідеї та методи у виробництво широкого спектра біологічно активних речовин. На початку XXI в. мікробіологія становить один з основних напрямків медицини, відкриваючи нові горизонти для різних її
  3.  Генетика бактерій
      генна інженерія, методи якої дозволяють змінювати структуру генів і включати в хромосому бактерій гени інших організмів, відповідальних за синтез важливих і потрібних речовин, які отримати хімічним шляхом дуже важко, - інсулін, інтерферон та ін; * при використанні мутагенних факторів (УФ-променів , рентгенівські промені, у-промені, діетилсульфат та ін) були отримані мутанти - продуценти
  4.  Тема: Біотехнологія і генна інженерія
      генна та клітинна інженерія). Продукція біотехнології. Сучасна наукова і промислова база біотехнології. Генетична інженерія - серцевина сучасної біотехнології. Поняття про гені і способах його отримання (клонування, секвенування, хімічний синтез). Принципи отримання рекомбінантних ДНК, створення векторів (плазмід, ДНК-фагів, вірусів, космід). Введення рекомбінантних ДНК в
  5. Г
      генна інженерія, генетична інженерія, розділ молекулярної біології та генетики, що займається цілеспрямованим конструюванням нових, неіснуючих у природі поєднань генів за допомогою генетичних і біохімічних методів. Р. і. заснована на виділенні з генома одного організму гена (або групи генів), з'єднанні його з певним носієм - «вектором» (молекулами нуклеїнових кислот,
  6. М
      генна інженерія. + + + Молібденовий токсикоз, хронічне отруєння жуйних молібденом. Виникає при вживанні кормів, що містять надмірну кількість молібдену. Найчастіше захворює велика рогата худоба, рідше вівці. У великої рогатої худоби спостерігають розлади травлення (проноси), виснаження. У овець, особливо у ягнят, виникають важкі атаксические ураження нервової системи у формі
  7.  Шпаргалка. Ветеринарна генетика, 2011
      інженерія.Практіческое використання груп крові та поліморфних систем у тваринництві Генетичний вантаж популяцій.Методи отримання трансгенних
  8.  ВСТУП
      генна інженерія. Отже, сучасний лікар з комунальної гігієни не може працювати ефективно, якщо він не володіє персональним комп'ютером і не користується мережею Інтернет, іншими інформаційними джерелами. Лікарі-профілактики з комунальної гігієни не можуть володіти тонкощами роботи інших фахівців (інженерів, сантехніків, архітекторів, геологів, гідрогеологів, метеорологів,
  9.  2. ЗМІСТ ДИСЦИПЛІНИ
      інженерії нових мікроорганізмів, антигенів, антитіл, імуномодуляторів до створення діагностичних, профілактичних і лікувальних імунобіологічних препаратів нового покоління. Перераховані вище сучасні досягнення мікробіології та імунології, їх роль і значення в профілактичній і клінічній медицині, обгрунтовують важливість знань з бактеріології, вірусології та імунології,
  10.  Тема: Історія розвитку мікробіології
      інженерії для отримання вакцин та інших біологічно активних препаратів. Синтетичні, антіідіотіпіческіе вакцини. Роль вітчизняних вчених у розвитку мікробіології. Вклад І.І. Мечникова, Г.Н. Габричевского, Д.К. Заболотного, Н.Ф. Гамалії, Л.І. Зильбера, З.А. Єрмольєвої, Д.І. Іванівського, П.Ф. Здродовского, В.М. Жданова у розвитку медичної мікробіології, вірусології та імунології.
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...