загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Генетика вірусу грипу

А. Сугіура (A. SUGIURA)

I. ВСТУП. ІСТОРИЧНИЙ ОГЛЯД

Дана глава написана не з метою дати огляд всієї літератури, що відноситься ж дослідженню генетики вірусу грипу. Більш докладно це зроблено в оглядах Kjlbourne (1963) і Hoyle (1968). Я спробував простежити, намагаючись дотримуватися хронологічного порядку, тільки за тими даними, які безпосередньо привели до важливих концепціям і теорій; в цій галузі. Я також спробував дати нові пояснення деяким більш старим експериментальним даним, використовуючи употребляемвую нині термінологію, і модифікувати деякі колишні інтерпретації, що опинилися неспроможними, у світлі сучасних знань. Історія досліджень генетики вірусу грипу розбита на два періоди. Перша фаза охоплює приблизно всі 50-ті роки, тоді як події з початку 60-х років до теперішнього часу будуть розглядатися як другий період, настання якого було відзначено широким використанням культур клітин і застосуванням-методу бляшок.

А. ДОСЛІДЖЕННЯ ПО ГЕНЕТИЦІ У ПЕРШОМУ ПЕРІОДІ

Перші свідчення генетичних взаємодій виру

сов грипу були отримані Burnet і Lind (1949) при изуче

нии феномена 'інтерференції в мозку мишей. З мозку ми

шей, заражених одночасно нейротропним варіантом

(NWS) штаму WS я іншими ненейротропнимі штамами,

WSM або SW- 15, вони виділяли штами вірусу, які яв

але успадковували ознаки обох вводяться вірусів, а саме

володіли нейровірулентностио NWS, але мали або підвалина

чівий до нагрівання НА WSM, або серологічний тип

штаму SW-15. Протягом наступних 10 років Burnet і його

співробітники були провідними дослідниками генетики вірусу

грипу.

У 1951 р. Henle і Liu знайшли, що множинна інфекція клітин аллантоїса штамом PR8 (А) або Lee (В) вірусів грипу, інактивованих ультрафіолетовим опроміненням чи нагріванням, призводить до часткового відновлення загубленої інфекційності. Вони інтерпретували цей феномен як аналог множинної реактивації у Т-парних бактеріофагів, тобто. Як форму генетичних взаємодій між різними вірусними геномами всередині одного і того ж штаму.

У 1952 р. Appleby повідомив про виділення нового штаму вірусу з курячих ембріонів, які отримали суміш штамів NWS і Kunz, інактивованих ультрафіолетовим опроміненням. Цей новий вірус мав серологічні властивості штаму Kunz, але щодо тканинного тропізму поводився аналогічно батьківському штаму NWS, тобто володів нейрові-рулентностью і латогеннимі при інтраназальноі інокуляції мишам. Поява цього вірусу пояснили рекомбинацией.

У 1953 р. Hirst і Gotlieb (1953a) почали роботи з генетики вірусу грипу, і їх група разом з групою Burnet склали дві основні школи в цій галузі в 50-і роки. Серед інших комбінаційних форм штамів WSN і Mel Hirst і Gotlieb отримали вірус ХЗ, який, мабуть, успадковував антигени від обох батьківських вірусів і був стабільний при повторюваних пасажах при граничних розведеннях.

У 1955 р. Baron. Та Jensen встановили, що генетичні ознаки штамів NWS або Wright, інактивованих ультрафіолетовим опроміненням, можуть бути врятовані у змішаній інфекції з активним вірусам. Вірус-нащадок мав генетичні характеристики неактивного батьківського штаму, а серотип-активного штаму.

Таким чином, існування генетичних взаємодій або генетичної рекомбінації було твердо встановлено. Декількома групами дослідників, які працювали незалежно.

1. Дослідження з генетики, проведені Burnet і співробітниками

На початку досліджень з генетики в якості донора генетичних властивостей застосовували майже виключно NWS - нейротропний варіант штаму WS в силу його унікального властивості: здібності розмножуватися в мозку мишей, викликаючи порушення координації, параліч і смерть після інтра-церебрального введення. У дослідах Burnet і Lind (1951a) іншим партнером служив WSM - ненейротропное похідне штаму WS. Крім нейровірулентность, NWS і WSM відрізнялися по стабільності НА. Гемагглютінірующімі активність NWS зникала в результаті нагрівання при 54 ° С протягом 30 хв, тоді як НА WSM витримував нагрівання при 62 ° С. Після того як суміш цих двох вірусів у відповідній-пропорції ввели <в. Мозок мишам, були виділені штами вірусів, позначені WS-NM, які виявилися нейровнрулентіимі для мишей, хоча і в різній мірі, але мали НА, настільки ж стійкий до нагрівання, як і у штаму WSM. Ці властивості залишалися стабільними протягом по. Принаймні двох пасажів в курячих ембріонах при граничних розведеннях.

У наступній серії експериментів (Burnet, Lind, 1951b; Burnet, Edney, 1951) було використано кілька генетичних маркерів при рекомбінації штаму NWS зі штамом Mel - ненейротропним штамом, що належить до серологическому підтипу, відмінному OTNWS. З мозку мишей, які зазнали змішаної інфекції,-були виділені іейротроп-ні реком'бінанти з серологічними властивостями штаму Mel (NM-штами). Віруси NM володіли рисами вихідного штаму Mel, такими, як термостабільність НА і аглютинація еритроцитів, оброблених ферментом, що руйнує рецептори (RDE). З іншого боку, NM-рекомбінан-ти надавали знижене ферхмеятатівное вплив-на овомуціновий інгібітор і насилу елюювали з еритроцитів. Цими властивостями вони були схожі на батьківський штам NWS. Однак на відміну від цього вихідного штаму вони легко переходили в индикаторное состояніе1. Ці властивості NM-pe-камбінантов можуть бути пояснені відносно слабкою і 1 термолабільної активністю NA, характерною для штаму NWS. Штам Mel не може бути переведений в индикаторное стан 'завдяки присутності стабільної NA. Штам NWS також не може бути переведений в цей стан, але через свій термолабільного НА. Тільки коли термостабільний НА штаму Mel і термолабільного NA штаму NWS об'єднувалися в NM-рекомбінантов, той ставав здатним переходити в индикаторное стан шляхом диференціальної інактивації. У рекомбінантов NM можна бачити таку асоціацію генетичних характеристик, яка 'згодом була розвинена в концепції «зчеплених груп». Mel [НА (серотип Mel, термостабільний), NA (активна, термостабільна) ненейровірулентние]-NWS [НА (серотип NWS, термолабільних), NA '(слабка, термолабільних) ній-ровірулентние] ->-NM [НА (серотип Mel, термостабільний), NA (слабка, термолабільних) нейровірулентность].

1 Після прогріву деяких штамів вірусу грипу (зазвичай при 56 ° С протягом 60 хв) темагглютііацію можна 'було придушити за допомогою деяких муіопротеінов, до яких іепрогретий вірус нечутливий. Цей стан називають індикаторним. Перехід в индикаторное. Стан, як передбачається, є результатами інактивації NA.

Починаючи з 1952 р. в дослідах з генетики частіше, ніж NWS, починають використовувати в якості одного з учасників штам WSE, так як він краще росте в аллантоісной порожнини курячого ембріона. Пара штамів WSE і Mel була, ймовірно, найбільш інтенсивно вивченої комбінацією в дослідженнях генетики вірусу грипу. Найбільш важливі дані, отримані в цій серії дослідів, можуть бути підсумовані таким чином.

А) Фенотипическое смешеніе.Потомственний вірус зі змішаної інфекції, особливо коли в ньому знаходили нейротропні рекомбінанти NM, нейтралізувався як анти-Mel так і aнти-NWS-сироватками (Fraser, 1953). Цей аномальний НА, за визначенням Fraser, відрізнявся від простої суміші штамів Mel і NWS і вказував на те, що більшість вірусних частинок має на своїй поверхні антигенну мозаїку.

Б) Здатність інактивованої вірусу брати участь в генетичних взаємодіях. Інактивація одного з компонентів нагріванням при 56 ° С протягом 30 хв не запобігає появі рекомбінантов того ж серологічного типу, що 'і у прогрітого компонента (Burnet, Lind, 1954b). Відповідним чином підібрана ступінь інактивації одного з компонентів путам помірного прогрівання при 37 ° С протягом 7 днів навіть сприяє виявленню рекомбінантов. Проте вірус, інактівіраванний ефіром, був нездатний утворювати рекомбінанти (Fraser, 1959a).

В) Групи зчеплення. Штами Mel, або WSE, лібо.И \ відрізнялися по ряду легковиявляемих ознак (табл. 18). Ознаки штаму Mel були позначені як ABCDEF, штаму WSE - abcdef, а штаму NWS - b (c) (d) efg.

У цьому випадку застосована процедура селекції не дозволяє виділити зворотний форму рекомбінантов. Ознаки ABDF, abdf завжди були пов'язані (зчеплені) і, таким чином, складали одну групу зчеплення, а ознаки РЄ, се або CEG, ceg - іншу. З точки зору загальноприйнятої нині теорії генетики вірусу грипу, яка передбачає, що кожен фрагмент РНК кодує один гаоліпептід, існування груп зчеплення незрозуміло, якщо не-припускати, що всі зчеплені маркери являють собою різні Феноти-пічешіе прояви одного кодованого вірусом білка. Наведені дані можна інтерпретувати так. ABD і abd є, безсумнівно, фенотипами НА *, а 'С і с - - NA * штамів Mel і NWS відповідно. Причина того, що НА * прогрітого штаму Mel НЕ ингибировал муцином слини овець, могла полягати в відсутність у НА * штаму Mel кошти до цього інгібітору. З іншого боку, НА * штаму Mel міг мати спорідненість до овомуціну або Меконій-ву інгібітору, але оскільки його NA термостабильна і здатна руйнувати ці інгібітори навіть після прогрівання, в застосованої реакції гальмування гем.агглютінаціі придушення гемагглютінірующей активності не відбувалося. Для штаму NWS ситуація була протилежною. Як вже обговорювалося, властивість С, з представляє термостабільяость NA *. Якщо ця інтерпретація вірна, то здатність до зростання в легенях мишей визначалася НА * NWS. Слід, однак, відзначити, що специфічне зчеплення маркерів має місце тільки при специфічної комбінації батьківських штамів вірусу; при рекомбінації штамів WSE і САМ властивості F і I успадковувалися незалежно від властивостей НА * (Burnet, Lind, 1955). Для нейровірулентность присутність NA * NWS, мабуть, було необхідно принаймні для комбінації NWS та інших H0N1 або HswlNl штамів. Всі нейротропні рекомбінаяти, отримані Burnet і співавт. з штаму NWS як одного з компонентів і штамів WSM, SW-15, Mel або Ocean Island в якості інших, несли фенотипи, відповідні NA * NWS (Burnet, Lind, 1951a, b). Нейротропний варіант, отриманий незалежно Appleby (1952) шляхом схрещування штамів NWS і Kunz, також мав властивості, узгоджуються з цією моделлю. Рекомбінант NK виразно володів ееротіпом Kunz в реакції гальмування гемалглютінаціі, так само як і при нейтралізації in ovo, але злегка нейтралізувався і | антисироваткою до NWS. Відносно тканинного тропізму він був так само нейровіру-стрічкою, як і штам NWS. Цей рекомбінант нагадував штам NWS і по. своєї чутливості до інгібітору слини, і по низькій активності ферменту (нейрамінідаза). NK, ймовірно, отримав НА * від штаму Kunz, a NA * - від штаму NWS. Невеликий ступінь нейтралізації анти-NWS-cbiBOpOT-кой могла бути причиною придушення багатоциклового зростання вірусу в умовах постійної присутності антитіл, спрямованих проти NA (див. гл. 12).

Вважалося, що патогенноеть для курячих ембріонів при інокуляції в хоріон-аллантоіс (властивість е) була тісно пов'язана з нейровірулеятностио для мишей (g) і з термолабільністю NA * NWS (с). Однак ці два види вірулентності служать, очевидно, різними проявами одного і того ж генотипу. Fraser (1959d) порівняв вірулентність для двох названих господарів у різних штамів рекомбі-Нант NM, виділених або з мозку мишей, або з мозку курячих ембріонів. Всі штами, слабопатогеннимі для курячих ембріонів, виявилися нелатогеяяимі при внутрімозго-вом введенні мишам. Автор зробив висновок, що ці дві патоген-ності були різними ступенями одного і того ж на-следуемая якості, і нейровірулентность для мишей може бути виявлена ??тільки за умови досягнення деякого рівня патогенності і для курячих ембріонів.

Г) Висока частота рекомбінації. При проведенні цих досліджень вірусні клони виділяли виключно з ембріонів, заражених у граничному розведенні. Мінорні типи у вірусному потомстві зазвичай не могли бути отримані до тих пір, "поки не використовувалися дуже великі кількості ембріонів. В болишінстве випадків ракомбінанти виділяли за допомогою таких методів селекції, як використання антисироватки пли застосування обмежує системи клітин-господарів, або часто обох цих методів . Отже, частота рекомбінації або частка рекомбінантов у вірусному прийдешнім не могла бути визначена. Тільки при схрещуванні штамів Mel і WSE, коли обидва типи вірусів виростали до приблизно однакових рівнів, рекомбінацію досліджували кількісно (Burnet, Lind, 1952). Після зараження яєць,

позбавлених ембріонів, 'великими концентраціями обох вірусів, достатніми для' інфікування всіх клітин одночасно, інокуліруют вірус видаляли за допомогою рецептор-руйнуючої ферменту (RDE). Урожай після одного циклу, знятий через 6-б '/ г ч, аналізували, виділяючи вірусні клони при граничних розведеннях і визначаючи властивості окремих клонів. Серед 41 дослідженого клона 'було 22 Mel, 6 М +, 9 WS ~ і 4 WSE. Таким чином, частота рекомбінації дорівнювала 15/41, або 37% .

д) Перерозподіл вірулентності. Коли рекомбінація між NWS і Mel мала місце в мозку мишей або в хор'іон-алланто'ісе (курячих ембріонів - селективних господарях для нейротропних вірусних штамів, легко виявлялися властивості ( ABDF-ceg) яейротропного штаму Mel. Коли ж змішана інфекція проводилася в аллантоісной порожнини і клони потомственого вірусу виділяли без селектірующего процесу, штами з комбінованими властивостями А-се проявляли весь спектр нейролатогенності-від фактичної відсутності вірулентності до повної вірулентності, порівнянної з вірулентністю батьківського штахмма NWS, але переважали рекомбінанти з низькою або сумнівної вірулентністю. Однак ці рекомбінаяти з низькою або проміжної патогенностио хоча і не приводили до загибелі дорослих мишей після внутрімоегового введення, але до певної міри розмножувалися в мозку і викликали смертельні інфекції при інокуляції в мозок 2-4 - денним мишам (Lind, Burnet, 1957). Ці штами були, принаймні частково, нейротропними. Аналогічну варіабельність 'патогенності NM рекомбінантов спостерігав Fraser (1959) при введенні в хоріон-аллантоіс. Вона змінювалася від повної вірулентності, тобто інвазії ембріонів з геморагічними ушкодженнями і подальшої смертю, до продукції добре виявляються фокусів на хоріон-аллантоіс, але без інвазії ембріона. Як вказувалося, патогенність для курячих ембріонів і нейровірулентность для мишей корелювали. При використанні вірулентності в якості маркера майже неминуче доводиться стикатися з такою непостійністю її прояви. Burnet і співавт. назвали цей феномен «перерозподілом вірулентності»,, і це 'був, ймовірно, феномен, найбільш важкий для пояснення в' генетичних термінах. Вводячи слово «перерозподіл», автори вважали, що ступінь вірулентності визначається кількістю містяться в індивідуальному вірусному геномі незалежно реплікується і перерозподіляє в процесі генетичного взаємодії копій передбачуваного «вирулентного гена» (Burnet, Lind, 1954a) або кількістю копій в рівній мірі передбачуваного «супрессорного гена» у разі авірулентних мутантів (Lind, Burnet, 1958). Позд-

  неї інші дослідники були схильні розглядати 'вірулентність скоріше як мультітенность, не обумовлюючи, чи означає це існування безлічі копій з одного і того ж гена або що вірулентність має складний характер, який визначається більш ніж одним геном. При інтерпретації генетичних досліджень, в яких вірулентність виступала як маркер, необхідно мати <на увазі два наступних обставини. По-перше, варіабельність прояви вірулентності жодним чином не характерна для рекомбінантов, що походять від вирулентного батьківського штаму. Навіть NWS сам по собі більш-менш схильний до змін, якщо тільки не розмножується в мозку мишей (що забезпечує постійний відбір вірулентних форм на тлі форм, менш вірулентних) або Пасеруйте в аллантоісной порожнини при граничному розведенні (що підтримує початкові властивості). При пасажах в останньому випадку при менших розведеннях незмінно мається постеленний зрушення в бік меншої нейровірулентноеті (Burnet, 1951), який вказує на те, що вона не дає переваги цього вірусу в даній системі і що мутації в бік меншої вірулентності щодо часті. По-друге, вірулентність на відміну від інших маркерів in vitro (таких, як серотип «Чи термостабільність НА *) є властивістю, яке можна розпізнати тільки після інтенсивного розмноження вірусів, і, отже, може бути схильна до змін в будь-якій стадії: багатоциклового зростання вірусів. Щоб вірулентність стала очевидною, кожна стадія повинна протікати з максимальною ефективністю. Найменша несумісність між різними генами всередині генома або введення невідповідного гена, що не має відношення до передбачуваного гену вірулен'гтшгті можуть пяггтпоіть ефективність процесу, приводячи до зменшеної вірулентності. Як приклад можна вказати на мутацію рекомбінантов М + (ABDF-ce) у бік M + d (AbdF'-cE) 1, прл якої зміна в першій групі зчеплення від ABDF до AbdF '(втрата термостабильности НА *, придбання спорідненості до мукоїдного -му рецептора овець і подальша аттенуація патогенності для легких мишей) супроводжувалося втратою патогенності для курячих ембріонів при інокуляції в хоріон-аллантоіс - змінами, що зачіпають другу групу зчеплення (Burnet, Lind, 1957b).

  2. Дослідження з генетики, проведені Hirst і Gotlieb

  Hirst і Gotlieb (1953) використовували у своїх дослідженнях тільки штами Mel і WSN. Останній був нейро-тропний 'варіантом штаму WS, еквівалентним NWS, «про з іншого джерела. Змішані інфекції вивчали в аллая-тоісной порожнини курячих ембріонів. Далі будуть підсумовані найважливіші результати, отримані зазначеними авторами. Форма XI була результатом фенотипического змішання.

  Х2: ця форма також схильна подвійний нейтралізації, як і XI, але відрізняється від XI тим, що при граничних розведеннях (наявність однієї інфекційної частинки) дає зростання потомства, що містить штами Mel і WSN, а, крім того, іноді ще й Х2. Отже, форма Х2 може розмножуватися принаймні протягом декількох генерацій при граничних розведеннях без зміни свого характеру, але врешті-решт може ліквідуватися. Вважали, що вона є наслідком гетерозігозіса або діплоїден.

  ХЗ: тільки один штам цієї форми був отриманий у всій серії дослідів, що включає більше 20 пасажів форми Х2. Форма ХЗ, мабуть, була істинним і стабільним реком-бінантом, який давав продуктивне потомство (протягом щонайменше 5 пасажів при граничних инфицирующих розведеннях) без збільшення виходу Mel або WSN. Анти-WSN-сироватка різко гальмувала гемаглютинацію ХЗ, але на відміну від XI або Х2 анти-Ме1-сироватка інгібувати ХЗ слабо, тобто тільки при дуже великих концентраціях (табл. 20). Звідси був зроблений висновок, що ХЗ несе дві ан-

  тлгенние специфічності: основний антиген, отриманий від штаму WSN, і мінорний антиген, отриманий від штаму Mel. Ретроспективно видається ймовірним, що ХЗ був реком'бінантом, що містить НА * штаму WSN і NA * штаму Ме.1; слабке інгібування анти-Ме1-сироваткою пояснювалося стеричним ефектам (див. гл. 12). Нейтралізація ХЗ in ovo анти-Ме1-сироваткою більшою мірою, ніж очікувалося з її титру в реакції гальмування гемаглютинації, також узгоджується з наведеним припущенням, оскільки тривалий присутність антитіл, спрямованих проти NA *, може знижувати вихід вірусу до рівня, нижчого, ніж той, який можна визначити за гемагглютіна-

  ції. Це створює видимість більшою мірою нейтралізації, ніж є насправді (див. гл. 12).

  б) Поведінка маркера нейровірулентность. При дослідженнях рекомбінації між WSN і Mel автори використовували тільки два маркера: наявність або відсутність нейровірулентность для мишей і серологічний тип. Як було виявлено, рекомбінанти виявилися дуже асиметричними. У той час 'як рекомбінанти WS-типу, що втратили нейро-вірулентність (W ") 1, виявлялися без праці, протилежний тип, тобто нейровірулентность Mel (M +), що не зустрічався (Hirst, Gotlieb, 1955). Тільки при реактивації штаму Mel, інактивованої ультрафіолетом, інфекційним штамом WSN було виявлено існування рекомбінантов М +, хоча нейровірулентность деяких рекомбінантов була нестабільною і мінялася від пасажу до пасажу (Gotlieb, Hirst, 1956). Однак деякі штами потомственого вірусу Mel-типу, ненейровірулентние при прямому інтраце- ребральном введенні мишам, були, як було показано, потенційно або стенотіпіческі нейровірулентность, оскільки їх схрещування з W ~ - іенейровірулентним реком-бінантом - призводило до утворення безсумнівно нейротроп-ного WSN. Цей феномен аналогічний перерозподілу вірулентності, наблюдавшемуся в 'дослідженнях Burnet і співавт. (розділ IA, 1д). Вірулентність рекомбінантов М + змінювалася від повної відсутності до майже еквівалентної штаму WSN, причому домінували невірулентние форми. В фенотіпічеокі невірулентние рекомбінантов М + ген нейро-вірулеятності, мабуть, мав перешкоду для свого прояву при комбінуванні з серотипом Mel. Тільки при його рекомбінації з серотипом WS вірулентність відновлювалася до рівня останнього.

  в) Роль гетерозигот в рекомбінації. У ряді дослідів суміш вірусів Mel (М ~) і WSN (W +),-кожен при високій концентрації, інокулював в аллантоісную порожнину цілих курячих ембріонів або запліднених яєць (Hirst, Gotlieb, 1955). Клони виділяли при граничному інфекційному розведенні (розведення, при якому 25% ембріонів або менше виявляються зараженими) із змішаних врожаїв вірусу без використання антисироватки в цілях селекції. З 220 виділених клонів за подальших пасажах 85 давали урожай тільки М-типу, а 58 - тільки W-типу. Решта 77 клонів давали початок обом типам (М і W) при наступної генерації. Ці клони були, отже, сіро-типовими гетерозиготами або, більш точно, діплоїден,

  бо так звані гетерозиготи часто є гетерозиготними за декількома факторами. Потомство W-типу, отримане з таких гетерозигот, містило разюче високу частку ненейровірулентного WSN [(W ~) рекомбінантов щодо серотипу і нейровірулентность], а саме 41 клон з 77. На противагу цьому тільки 2 з 58 гомозиготних клонів W-типу були W ~. Hirst і Gotlieb (1955) припустили, що гетерозиготи є попередньою стадією, що приводить до утворення рекомбінантов. Так як гетерозиготи теж були фенотіліческі змішаними, тобто схильними подвійний нейтралізації, використання антисироватки для цілей селекції певного типу потомства сильно знижувало шанси виявити рекомбінанти. У даних дослідженнях цих авторів частка гетерозигот зазвичай була дуже висока (в описаних вище дослідах - 77/220, або 35%). З іншого боку, Lind і Burnet (1975a) виявили гетерозиготи в меншій пропорції: три серотіпіческіе гетерозиготи в 24 клонах, виділених при схрещуванні штамів NWSE і Mel. Більше того, вони виявили високу частку рекомбінантов і не вважали, що гетерозиготи грають скільки-небудь значну роль у їх провадженні. Чому виникло таке розбіжність в результатах, отриманих двома групами авторів, пояснити не можна. Існування гетерозигот саме по собі сумнівно, особливо в світлі недавніх отриманих даних про універсальний феномен існування агрегатів вірусних частинок '(Hirst, 1973). Представляється, що роль гетерозигот або агрегатів у формуванні рекомбінантов залишається поки невідомою.

  Протягом першого періоду досліджень відсутність точних методів підрахунку інфекційного вірусу і надійних способів отримання чистих клонів було головною перешкодою на шляху до прогресу. Інфекційність доводилося вимірювати шляхом титрування в аллантоісной порожнини курячих ембріонів, а єдиним практичним способом. Отримання чистих клонів було використання повторюваних пасажів при граничних инфицирующих розведеннях знову-таки в аллантоісной порожнини. Будь-які скільки-небудь значні досліди вимагали величезної кількості ембріонів. Burnet сам описав цю ситуацію. Після 10-річного вивчення рекомбінації вірусів грипу та багатьох спроб звести ці явища в задовільну модель (деякі з цих спроб були опубліковані) автор був змушений відступити на майже нігілістичні позиції. У всіх кількісних експериментах непостійність результатів таке, що для даних по виявленню, наприклад, лінійної послідовності генетичних детермінант певних властивостей були б необхідні настільки великі досліди, які перевищують можливості будь-якій лабораторії, яка цікавиться подібної

  проблемою. Можливо, зараз є сенс всім групам, які цікавляться генетикою вірусу грипу, припинити публікацію статей на цю тему. Немає сумніву у всіх одержуваних фактах, але відсутній теоретична основа, в рамках якої вони можуть бути представлені (Burnet, 1960).

  Однак, незважаючи на обмеження, чудово те, що ці ранні роботи мали істотний вплив на подальші дослідження. Майже всі основні концепції, все ще поширені зараз,-фенотипическое змішання, гетерозігозіс, зчеплені групи, висока частота рекомбінації, генетична компетентність інактівіроваіного вірусу - були сформульовані вже в той період.

  Б. ДОСЛІДЖЕННЯ ПО ГЕНЕТИЦІ У ДРУГОМУ ПЕРІОДІ

  Другий період почався роботою, проведеною Simpson і Hirst (1971), які вперше застосували метод бляшок в дослідженнях генетики вірусу грипу. Незважаючи на плідне використання ними культур клітин і методу бляшок і наступні технічні удосконалення, прогрес у цій галузі обмежувався розбірливістю більшості штамів вірусу грипу по відношенню до культур клітин на відміну від інших вірусів, які легше можуть бути адап-ri тувати до культур клітин. Ця проблема, що турбує нас і сьогодні, є причиною пристрасті дослідників в роботах з генетики до вірусів WSN, NWS і до вірусу чуми птахів (ВЧП), які добре утворюють бляшки в багатьох системах культур клітин. Оскільки вишукування цього періоду є по суті дослідженнями нинішнього дя-я і навряд чи потребують детального описі і переосмислюючи-нли, основні досягнення будуть підсумовані лише в досить стислому вигляді.

  Simpson і Hirst (1961) використовували штам WSN як донор бляшкообразующіх властивостей для інших штамів вірусу грипу типу А, що не утворюють бляшок зовсім або утворюють їх погано з дуже низькою ефективністю на клітинах курячого ембріона. WSN давав урожай з високим титром і утворював великі і чіткі бляшки з ефективністю, майже рівної ефективності зараження ембріонів в аллан-тоісную порожнину. Змішана інфекція клітин курячого ембріона вірусом WSN, інактивованим ультрафіолетовим опроміненням, і штамами інфекційними, але не утворюють бляшок або утворюють їх погано, призводить до появи бляшок в кількостях, що значно перевершують ті, які обумовлені залишкової інфекціонностио WSN. Більшість бляшок, отриманих внаслідок крос-реактивації, за своїми розмірами і морфології помітно відрізнялися від бляшок, утворених вірусом WSN. Штами вірусів, виділені з таких бляшок, зазвичай володіли властивостями, успадкованими від реактивувати, що не утворюють бляшок, батьківських штамів. Крос-реактивация виявилася дуже ефективним способом отримання рекомбінантов і таким шляхом були отримані бляшкообразующіх рекомбі-Нант багатьох серотипів: WS, Mel, PR8, FM-1, S-1, Японія 305 і грип свиней.

  У 1962 р. Hirst висунув гіпотезу, яка повинна була послужити основним поштовхом до подальших досліджень вірусу грипу. Ця гіпотеза полягає по суті з двох окремих, хоча і взаємопов'язаних, постулатів. По-перше, автор припустив, що кількість РНК, що міститься в геномі вірусу грипу, змінюється від частинки до частинки. Цей висновок був зроблений на підставі фізичної та морфологічної 'гетерогенності, що спостерігається у вірусних частинок в стандартних препаратах, недосконалості способу дозрівання вірусів і частої появи гетерозигот. За винятком неповного вірусу (феномен фон-Магнуса), обгрунтованість цього припущення сьогодні ще далеко не доведена, що обговорюватиметься в розділі VA, 3. По-друге, РНК вірусу грипу існує у вигляді еубгеномних фрагментів, здатних, можливо, напівавтономних реплицироваться і випадково перерозподілятися в процесі складання віріонів. Виходячи з розмірів РНК вірусу грипу і грунтуючись на досвіді, набутому при роботі з ДНК-містять бактеріофагами і поліовірусом, не можна було очікувати частоти рекомбінації більшою, ніж 1%, якщо вона має той же механізм. Спостережуваний значно вищий рівень рекомбінації міг бути пояснений тільки генетичними впливами, що відбуваються по якомусь незвичному механізму. Прототип цієї гіпотези можна виявити вже в роботах 1952 р., в яких передбачалися групи зчеплення (див. розділ IA, 1'в), а подібний механізм рекомбінації менш точно був визначений у роботі Burnet (1956). Але розмежування між різними 'Субгеномнимі фрагментами і безліччю копій з одного і того ж фрагмента в той час проведено не було. У цій гіпотезі безумовно був проголошений лише екстраординарний механізм генетичних взаємодій. Через 4 роки гіпотеза «дрібного генома» була частково підтверджена відкриттям невеликих і гетерогенних фрагментів РНК, екстрагованих з вірусу грипу (Davis, Barry, 1966), а також безліччю біофізичних і хімічних даних, що призводять до такого ж висновку (Shatkin, 1971; Young, Content, 1971; Lewandowski et al., 1971; Bishop et al., 1971; Skehel, 1971; Horst et al., 1972; Bromley, Barry, 1973).

  Tumova і Pereira (1965) використовували метод Simpson і Hirst (1961), але вони вибрали вірус чуми птахів (FPV) як

  бляшкообразующіх вірус, який повинен бути реактивований, і вірус А2 - як реактівант. Все більш ніж 50 клонів, отриманих з реактивувати бляшок, містили НА FPV. Однак тест на 'Штаммоепеціфіческую фіксацію комплементу приблизно в половині ракомбінантов виявив на додаток ж FPV-антигену і А2-антиген. Пізніше А2-антиген, що міститься в одному з таких антигенних гібридів FPV-A2 (R4), був ідентифікований як NA вірусу А2 (Eas-terday et al., 1969).

  Одночасно і незалежно проведені експерименти Kilbourne і співавт. (Kilbourne, Schulman, 1965; Jahiel, Kilbour-ne, 1966; Kilbourne et al., 1967) з рекомбінантов вірусів NSW (H0N1) і RI / 5 + (H2N2) переконливо показали за допомогою ряду серологічних методів легкість отримання «антигенних гібридів» . Успіху цих експериментів сприяло застосування нової бляшкообразующіх системи для вірусу грипу - анеуплоїдних клітин людини, клон 1-5С-4 (Sugiura, Kilbourne, 1965). Оскільки м'ногіе штами, включаючи NWS, утворюють бляшки на цій лінії клітин, можна було підрахувати всі типи потомственого вірусу, що утворюється при змішаній інфекції, що дозволяло визначити частоту рекомбінації. При використанні двухфакторного схрещування, що включає вид оеротіла і тип бляшок, було показано, що частота рекомбінації досягає 34% після одноціклового зростання штамів NW.S і 'САМ, що підтверджувало дані, отримані раніше Burnet і Lind (1952) (див. розділ IA, 1г) i (Sugiura, Kilbourne, 1966).

  У цій системі за допомогою феномена зменшення розміру бляшок було виявлено існування двох видів антигенів на поверхні вірусу (Kilbourne, Schulman, 1965; Jahiel, Kilbourne, 1966); це було зроблено при вивченні властивостей вірусу Х7 - антигенного гібрида, отриманого шляхом схрещування вірусів NWS і A2/RI/5 + / 57. Антисироватка до NWS або до RI / 5, включена в Агарові покриття, надавала істотно різний вплив на утворення бляшок вірусом Х7 на клітинах клона 1-5С-4. У той час як анти-NWS-cbiBO-ротика або повністю запобігала появі бляшок, або зменшувала як кількість, так і розмір бляшок, що виявляються при кінцевих розведеннях (інгабірованіе бляшок), анті-Ш/б-сиворотка помітно зменшувала лише розмір бляшок, які не впливаючи на їх число, в широкому діапазоні концентрацій сироватки '(зменшення розміру бляшок). Анті-Ш/5-сиворотка практично не впливала на Х7 в реакції нейтралізації перед інокуляцією і не придушувала гемаглютинації вірусу Х7. AHTH-NWS-сироватка, з іншого боку, нейтралізувала інфекційність і придушувала гемаглютинацію. Вірус Х7, крім НА *, отриманого безсумнівно, від NWS, містив 'антигенну детермінанту,

  отриману від вірусу А2. Раніше було показано, що імунізація мишей вірусом Х7, відомим тоді як вірус X (Kilbourne, Schulman, 1965), забезпечує захист проти введення будь-якого з батьківських вірусів. Те, що А2-антиген в дійсності була NA *, було доведено Laver і Kilbourne (1966) шляхом злектрофоретіческого аналізу вірусних структурних білків.

  Після Х7 Kilbourne (1968) аналогічним чином отримав кілька рекомбінантов, містять НА * вірусу грипу свиней і NA * вірусів грипу людини. Ці результати разом із зазначеними вище даними Tumova і Pereira (1965) призвели до висновку, що здатність до рекомбінації універсальна для всіх вірусів грипу А незалежно від видів господаря, з яких вони були виділені.

  | Виявлення NA * як компонента, антигенно відмінного від НА *, і існування рекомбінації по цих двох компонентів є, ймовірно, основним внеском генетичних експериментів у з'ясування структури 'віріона, але в поєднанні з виявленням генетичної сумісності між вірусами людини і тварин, також я в розуміння екологічних властивостей вірусу грипу (див. гл. 9 і 16).

  Протягом (багатьох років майже всі дослідження з генетики проводилися з використанням природних штамів вірусів, що відрізняються по ряду 'біологічних властивостей. Чи зумовлене виявляється відміну одним геном або воно полигенно за своєю природою,-було невідомо. Більш того, хоча для вірусу грипу придатне, мабуть, безліч маркерів, більшість з них служило, ймовірно, проявом дії лише декількох генів, зокрема тих, які мають відношення до білків поверхні віріона. Зміни в білках, що знаходяться всередині оболонки, не могли бути розпізнані. Fenner і Sambrook (1964 ) вказали на недоліки такого підходу і підкреслили важливість застосування умовно-летальних мутантів, які-були успішно використані в генетиці бактеріофагів. Це - мутанти, які не дають інфекційного потомства при певних, легковоспроізводі-мих умовах, але які реплікуються нормально або майже нормально при інших умовах. Теоретично можна було б отримати мутанти, лише на один крок віддалені від батьківського штаму або дикого типу вірусу. Через відсутність в клітинах тварин супрессорчувствітельних механізмів (Fenner, 1970) більшість умовно-летальних мутантів з вірусів тварин є темлературочувствітедь-ними.

  Перше виділення температурочувствітельной умовно-летальних (ts) мутантів було описано Simpson і Hirst (1968). ' Між певними парами цих мутантів спостерігалися як рекомбінація, так і комплементація, і вони були

  раз-біти «а п'ять жомллементаціонних груп. Ця була інша поворотна точка у дослідженнях генетики вірусу грипу. З тих лор різні групи дослідників виділили багато ts-мутанти, але вони будуть описані далі.

  II. ГЕНОМ ВІРУСУ ГРИПУ

  Оскільки про РНК вірусу грипу та її реплікації більш докладно говориться в гол. 6 і 8, далі 'будуть узагальнені лише ті аспекти, які мінімально необхідні для розуміння генетики. Генетична інформація для продукування інфекційного вірусного потомства закодована в віріовной однонитчатим РНК. Відомі в даний-час поліпептиди, що синтезуються в клітці, зараженої вірусом грипу А, наведені <в табл. 21 (White, 1974) (див. також гол. 2). Нали-

  чие поліпептидів Р2 і NS2 повинно 'бути ще підтверджено. Поліпептиди НА і NA після трансляції глікозіліруются. Поліпептид НА може перед включенням в вирион розділятися на HAi і голий шляхом протеолітічеокого розщеплення залежно від клітини-хазяїна або навколишніх умов (див. гл. 3). Ферментативно активна NA *, як відомо, є тетрамером, але наявні дані про склад тетра-міра ложа ще суперечливі: складається він з чотирьох ідентичних субодиниць (NA) або з двох молекул, кожна з яких містить дві різні субодиниці (NAi і NA2) ( см. гл. 4). Отже, мінімальне число поліпептидів, що кодуються вірусним геномом, має дорівнювати шести

  (Р, НА, NP, NA, М і NS), а максимальне - дев'яти - (Рь Р2, ПА, NP, NAb NA2, M, NSi і NS2). Кодування цих 6 -!> Продуктів діяльності генів вимагає розмірів онРНК від 4-Ю6 до 5-Ю6. Електрофоретичний аналіз РНК, екстрагованої з віріона, підтримує припущення, що вона існує у вигляді щонайменше п'яти, а максимально - | десяти фрагментів, розмір яких знаходиться в межах 2-Ю5-106. Загальна кількість РНК, що міститься в вирионе, знаходиться, як було встановлено, в межах між 4-Ю6 і 5-106 (Shatkin, 1971; Lewandowski et al., 1971; Young, Content, 1971; Bishop et al., 1971; Skehel , 1971; Horst et al., 1972; Bromley, Barry, 1973; див. також гл. 6). Передбачається, що вРНК транскрибується асоційованої з вирионом РНК-залежної РНК-полімеразою в комплементарную РНК, яка також існує у вигляді гетерогенних фрагментів, аналогічних за розмірами фрагментам вРНК. Найбільш достовірні дані дозволяють припустити, що комплементарні РНК є мРНК (Pons, 1972; Kingsbury, Webster, 1973; Etkind, Krug, 1974). На підставі приблизного відповідності між фрагментами РНК і поліпептидами не тільки за кількістю, але і за розмірами (максимальна кодирующая ємність онРНК розміром від 2-Ю5 до 10б відповідає поліпептидам від 22-Ю3 до 110-Ю3) можна припустити, що кожен фрагмент РНК є моноцістронним (Skehel, 1972). Досліди по гібридизації вРНК і днРНК, присутньої в заражених клітинах, вказують на те, що більшість фрагментів РНК має унікальну послідовність підстав і реплицируется-незалежно (Content, Dues-berg, 1971; Bromley, Barry, 1973). Синтез вРНК, ймовірно, відбувається на матриці комплементарної РНК. РНК-залежна РІК-полімераза, що каталізує цю реакцію, що не охарактеризована, але вона, оківідімому, відрізняється від вирион-ної транскриптази, блокируемой в заражених клітинах ак-тіноміціном D (Bean, Simpson, 1973), тоді як реплікація вРНК триває, незважаючи на присутність цього антибіотика (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Ймовірним кандидатом на роль зазначеного ферменту є РНК-залежна РНК-полімераза, синтезируемая в зараженій клітині, яка відрізняється від вирионной транскриптази по іонів, необхідним для реакції in vitro (Horisberger, Guskey, 1974). Тісний зв'язок NP-субодиниць як з вРНК, так і з комплементарної РНК вказує на те, що саме рібонуклеопро-теїн, а не вільна РНК, відіграє важливу роль в якості реплицирующейся та функціональної форми вірусного генома (Duesberg, 1969; Pons, 1971, 1972 ). Збереження в клітинах протягом 16-17 год здатного до реактивації генома, що не інак-тівіруемого 'внутрішньоклітинної рібонуклеазою (Gotlieb, Hirst, 1956; Kilbourne, I960), також може' бути пояснено суще-

  ствованию його IB вигляді РНП, який більш резистентний до цього ферменту, чам вільна РНК (Pons et al., 1969). Передбачалося, що геном вірусу грипу є-безперервної структурою, в якій фрагменти РНК утримуються разом за допомогою білкового остова, освіченого субодиницями NP (Pons, 1970). Такий механізм забезпечував би певну ступінь впорядкованості. При реплікації і збірці РНК, надавши можливість з'єднання всіх фрагментів РНК в процесі дозрівання.

  Вірус грипу В не вивчений так само докладно, як вірус грипу А. Фактично немає робіт про його РНК-Однак у світлі © го морфологічного і функціонального подібності, подоби структурних компонентів (Laver, Baker, 1972; Oxford, 1973) і порівнянної ефективності рекомбінації ( Tobita, Kilbour-ne, 1974) геном вірусу грипу типу В навряд чи сильно відрізняється від генома вірусу грипу А.

  (Dulbecco, Vogt, 1958), або злегка нижче швидкості придбання поліовірусом резистентності до гуанідином (Carp, 1963). Дикий тип ВЧП утворював мелкобляшечний мутант до с незвично високою частотою (Staiger, 1964). На жаль, цей феномен не був вивчений, і залишається невідомим чи дійсно він викликається мутаціями. Певні хімічні речовини, що змінюють структуру РНК або заважають правильному спаровування підстав. В процесі її реплікації, помітно збільшують частоту мутацій і використовуються як мутагени. Частота виділення ts-мутантів вірусу грипу при 'Використанні мутагенів або без них не дуже відрізняється від такої для інших вірусів. Враження про високу мута-бельности виникло, ймовірно, з незвичайних епідеміологічних особливостей вірусу грипу, включаючи часту антигенну мінливість (ем. тл. 10 і 15).

  III. МУТАЦІЇ, МІНЛИВІСТЬ, АДАПТАЦІЯ

  І КОНТРОЛЮЮТЬСЯ клітини-хазяїна

  МОДИФІКАЦІЇ

  А. МУТАЦІЇ І МІНЛИВІСТЬ

  Терміни «мутація» і «мінливість» часто вживають як взаємозамінні, але частіше з різними супутніми значеннями. Мутацію можна визначити як зміна спадкової ознаки, визв! Анное зміною геному. Мінливість, з іншого боку, зазвичай на увазі зміну, що є наслідком ряду мутацій і подальшого процесу селекції, але іноді цей термін включає зміни, не обов'язково приписувані мутації, як при антигенної мінливості, включаючи антигенний зрушення. Антигенна мінливість або антигенні зміни головним чином поверхневих гліколротеідов, що відбуваються в природі, будуть повною мірою розглядатися в гол. 10. Не існує експериментальних даних, що доводять загальноприйняту думку про явною лабільності або незвичайної мутабельності-сти вірусу грипу в порівнянні з іншими вірусами тварин. Мабуть, з цієї точки зору більш несподівана брак даних про мутації вірусу грипу. В одному з декількох досліджень, присвячених мутацій, рівень мутацій від стану чутливості до стану резистентне ™ до р-інгібітору в бичачої сироватці становив, згідно з розрахунками, від 0,7-10 ~ 8 до 3,3-10 ~ 8 на частку на одне подвоєння залежно від штаму. вірусу грипу (Medil-Brown, Briody, 1955). Це дорівнює приблизно '/ юоо від рівня мутацій, що призводять до d +-npn3HaKy у поліовірусу 224

  Б. АДАПТАЦІЯ

  Адаптація означає отримання спонтанних мутантів, часто, але не обов'язково, багатоступінчате, і ці мутанти мають здатність виживанням у певних господарів або при певних зовнішніх умовах, тобто адаптація - | це спроба викликати мінливість в напрямку, необхідному експериментатору. Класичним і, ймовірно, найбільш вивченим прикладом мінливості, пов'язаної з адаптацією, є О-D мінливість (Burnet, 1955). Деякі штами вірусу грипу A (H0N1 і H1N1) при первинному виділенні від людини ростуть тільки в амніотіческоі порожнини курячого ембріона. Заражена амніотічеокая рідина агглютинирует еритроцити людини і морської свинки, але не курячі еритроцити. Вірус з такими властивостями був названий О-вірусом, або вірусом у вихідній (original) фазі. У ході пасирування в аллантоісной порожнини вірус набуває здатність агглютинировать курячі еритроцити, а не тільки еритроцити людини і морської свинки. Така зміна супроводжується придбанням здатності розмножуватися і в аллантоісной порожнини. Ця властивість вірусу було віднесено до D фазі або до похідної (derivative) фазі. Пасажі О-ві-руса при граничних розведеннях підтримують цю властивість, а пасажі при невеликих розведеннях неминуче призводять до зміни від О-до D-фазі. Пояснення Burnet і Bull полягало в тому, що О-вірус постійно виробляє мутант D-форми (з встановленої ними-швидкістю 10 ~ 5 на частку на подвоєння), який краще, ніж О-вірус, пристосований до зростання в даному хазяїні і швидше в ньому розмножується. Якщо інфекцію в амніотіческоі порожнини ініціює розбавлений заражає матеріал, що містить тільки О-частини-ці, то вірус буде досягати кінцевого титру до появи

  значного. кількості D-форм, і в результаті амніоти-чна рідина все ще буде зберігати властивості О-вірусу. Однак, з іншого боку, якщо. Застосовувати заражає матеріал, що містить також невелику кількість D-частинок, D-форма. Поступово 'буде обганяти в зростанні О-іірус. Правило, що пасажі при граничних розведеннях зберігають вихідні властивості вірусу, тоді як пасажі з меншими розбавлені | благоприятствуют змін (поява і домінування мутантних форм, що володіють за даних умов перевагами у виживанні), як (було показано, є справедливим і для ряду інших випадків, таких, як морфологічна мінливість вірусних частинок від ниткоподібних форм. до сферичним (Burnet, Lind, 1957а) або ослаблення нейровірулентность штаму NWS при пасажах на ембріонах (Burnet, 1951).

  В. МОДИФІКАЦІЇ, КОНТРОЛЮЮТЬСЯ клітини-хазяїна

  Модифікації, контрольовані. Клітиною-господарем, є змінами вірусного фенотипу, обумовленими кліткою, в якій ріс вірус. Оскільки всі вірусні. Поліпептиди кодуються геномом вірусу, вони однаковою мірою незалежні від клітини-хазяїна. Проте всі вуглеводи і ліліди, що містяться у вірусі, та шляхи їх включення знаходяться під генетичним контролем клітини.

  1. Модифікація вірусних глікопротеїдів

  Гліколротеіди НА і NA частково визначаються кліткою, яка постачає ферменти, необхідні для синтезу вуглеводів і для гликозилирования поліпептидів, що кодуються вірусом. Отже, глікопротеїди вірусів з різних клітин можуть відрізнятися за електрофоретичної рухливості при аналізі а поліакриламідному гелі і по стабільності при різних диссоциирующих умовах (Haslarh et al., 1970; Schulze, 1970). Більш того, загальна кількість гли Еопротеідов, що містяться в вирионах, може змінюватися залежно від клітини-хазяїна (Lazarowitz et al., 1973). Висакоочіщенний. Вірус, виращеннийIB аллантоісной порожнини, містить антиген, присутній в нормальній аллантоісной рідини (Knight, 1944). Як було показано, цей антиген клітини-хазяїна є високомолекулярним углеводом, ковалентно прикріпленим до білка, ймовірно, до НА * (Harboe, 1963a, b; Haukenes et al., 1965; Laver, Webster, 1966). Недавнє повідомлення передбачає присутність хазяйського антигену клітини-господаря також і. У NA: |: (Haheim, Hau-kenes, 1973).

  2. Модифікація вірусної оболонки

  Оскільки оболонка. Вірусу грипу та 'близьких йому вірусів утворюється з плазматичної мембрани клітини в процесі отпочковиванія, хімічний склад ліпідів і гликолипидов оболонки (а отже, і вірусних частинок) має дуже близьку схожість зі складом плазматичної мембрани (Frommhagen et al., 1959; Klenk , Choppin, 1969, 1970). Варіації в чутливості вірусної інфекції до фосфоліпазу С засновані, мабуть, на відмінностях у складі ліпідів. Вірус, вирощений в аллантоісной порожнини,-був резистентний до фосфоліпазу С, тоді як вірус того ж самого штаму, вирощений в культурі клітин курячого ембріона, - високочутливим до неї (Simpson, Hauser, 1966). Антиген груяпи крові та антиген Форсман,. Присутні у вірусі, є гліколіпідами, отриманими від клітини-хазяїна (Rott et al., 1966; Klenk et al., 1972; Haheim, Haukenes, 1973).

  3 "Модифікації з допомогою протеолітичних ферментів

  Ступінь, до якої поліпептид НА розщеплюється перед включенням в віріони на HAi і НА2, часто визначається клітиною-господарем. Штами WSN і RI / 5 при вирощуванні в аллантоісной порожнини містять НА, розщепити в значно більшому ступені, ніж при вирощуванні в первинних клітинах нирок мавп (Lazarowitz et al., 1973; див. гл. 3). У разі вірусу Сендай розщеплення одного глікопептидами 'протеолітичними ферментами клітини є, мабуть, стадією, істотною для придбання гемолітичної активності, здатності викликати злиття клітин і інфек-ціонності (Homma, Ohuchi, 1973; Scheid, Choppin, 1974). Для вірусу грипу подібний 'механізм невідомий. Але в світлі того, що додавання протеолітичних ферментів в культури, заражені вірусом грипу, значно сприяє багатоциклової зростанню деяких штамів вірусу (Came et al., 1968; Tobita, Kilbourne, 1974; Appleyard, Maber, 1974), можна припустити аналогічну ситуацію також і для вірусу грипу.

  IV. ГЕНЕТИЧНІ МАРКЕРИ

  Оскільки проведено велику кількість досліджень з генетики вірусу грипу, було описано і багато 'Маркерів. Деякі є корисними і досі, але багато з них, мабуть, будуть мати невелику практичну цінність в (майбутніх дослідженнях. Незалежно від їх корисності маркери, часто вживалися в минулому, будуть раосмот-

  рени тут з метою з'ясування, наскільки це можливо,-генетичної обгрунтованості їх, виходячи з сьогоднішніх знань.

  А. МАРКЕРИ, ЗУМОВЛЕНІ фенотип ВІРУСУ

  1. Фенотипи, що відносяться до гемаглютиніну

  а) Серотип. Серотип НА * є найбільш добре оха

  характеризувати маркером НА *. Він може бути идентифи

  ства різними імунологічними методами: тормо

  ються гемаглютинації, нейтралізація, придушення бляшок

  (Jahiel, Kilbourne, 1966) або іммунодіффузія з урахуванням того,

  що антитіла до NA іноді викликають гальмування гемагглю-

  тінаціі або нейтралізацію (див. гл. 10). Антигенні Гібро

  ди всередині самого НА виявлені не були. Описані до

  Досі антигенні гібриди, що містять в нерівних пропор

  циях обидва батьківських антигену і які виявляються по подавле

  нию гемаглютинації або те реакції нейтралізації (Apple-

  . by, 1952; Hirst, Gotlieb, 1953b), були, ймовірно, гібридами, які отримали НА * від одного з батьківських вірусів,. a NA * - від іншого.

  б) Термостабільність гемагглютінірующей активності.

  При рекомбінації між штамами WSE і Mel відмінність

  з термостабільноеті було приписано НА *, оскільки вона б

  ла пов'язана з серотілом НА * (див. розділ IA, 1в). У деяких

  ts-мутантів, що володіють дефектним НА *, гемагглютінірующімі-

  щая активність була вельми термолабільної (Ueda, To-

  bita, Sugiura, неопубліковані дані). Однак були

  інші випадки, коли термоетабільность відокремлювалася від сіро-

  ТНПА НА * в процесі рекомбінації (Simpson, Hirst, 1961;

  Tumova, Pereira, 1965; McCahon, Schild, 1971), даючи основа

  ня припустити, що термостабільність гемагглютінірующімі

  щей активності може визначатися і деякими іншими

  вірусспеціфіческой структурними компонентами.

  в) Стабільність гемагглютінірующей активності по від

  носінню до хімічних речовин або ферментам. Стабиль

  ність по відношенню до додецилсульфат натрію (Simpson,

  1964) або до гуанідвнгідрохлоріду (David-West, 1973) явля

  ється, ймовірно, властивістю НА *. Але стабільність по відношенню

  нію до обробки трипсином, тобто ж протеолитическому отщеп

  лению шипів НА * від оболонки, мабуть, не визначає

  ся одним тільки НА *, оскільки це властивість може-бути відокремлене

  | Від серотипу НА * ('Kilbourne, 1963; Kilbourne et al., 1972).

  г) Спорідненість до рецептора. Здатність вірусу агглютіні

  ровать еритроцити різних видів тварин або еритро

  ціти, оброблені RDE, визначається головним чином

  | Спорідненістю НА * до рецептора. Однак видима гемагглютіна-

  ція, будучи комбінацією процесів прикріплення вірусу до

  рецептора і подальшої елюції в процесі ферментативного розщеплення речовини рецептора, може обумовлюватися і NA *. Це можна бачити на прикладі Х7 (НТШ)-реком-бінанта між штамами NWS (H0N1) і A/RI/5 + / 57 (H2N2). Незважаючи на нездатність обох батьківських вірусів елюіровать з курячих еритроцитів, рекомбінант Х7 швидко елюіруются з них. Цей «новий» фенотип, що купується в ході генетичного взаємодії, виходить, мабуть, із з'єднання низького в порівнянні з Н2 спорідненості АЛЕ до рецепторів еритроцитів з високою нейрамінідазной активністю N2 (Laver, Kilbourne, 1966). Спорідненість НА * до певних рецепторних речовинам виявляється іноді по чутливості «цим речовинам реакції гальмування гемаглютинації. Прогріті препарати WSE були чутливі до муцину слинних залоз овець, а прогріті препарати Mel нечутливі. Ці властивості були пов'язані з | серотілом НА * відповідних вірусів (розділ IA, 1в). Є два протилежних типу штамів вірусу H2N2, виділених в 1957 р., які різко відрізняються по чутливості до інгібітору, що міститься в нормальній кінської сироватці (Choppin, Tamm, 1960). Непрямі дані вказують на те, що це розходження притаманне НА *, а не NA *, ймовірно, внаслідок різного спорідненості гемагглютининов | до інгібітору (Choppin, Tamm, 1960; Sugiura et al., 1961; McCahon, Schild, 1971). Інтенсивна спроба відокремити в процесі генетичної рекомбінації чутливість до інгібітору від серотипу НА * виявилася марною (Kiibourne, неопубліковані дані).

  Оскільки НА * є продуктом одного гена, то у випадку мутації можна спостерігати спільне зміна наведених вище маркерів (а, Ь, с і d), що підтверджується прикладом мутації М + до M + d (розділ IA, 1в).

  2. Фенотипи, що відносяться до нейрамінідазі

  Хоча не вирішено, чи складається NA * з одного або двох типів поліпептідо'В, досі немає генетичних даних, які передбачають її подвійний генетичний контроль. Помітні відмінності в кількостях NA *, що припадають на вир іон, будуть описані далі (див. розділ IVA, 2г).

  а) Серотип. Серотип може бути ідентифікований за ре

  акції інгібування NA *, зменшення розмірів бляшок

  або по иммунодиффузии. Іноді його можна виявити також

  по гальмуванню реакції гемагглютінацін.

  б) Стабільність. Термостабільність може бути перевірена

  на безпосередньо in vitro (Drzeniek et al., 1966; Palese

  | Et al., 1974). До розробки нейрамінідазной реакції in vit

  ro в основному для визначення термостабільності NA * в ка

  честве маркера часто використовували здатність ферменту

  переходити в индикаторное стан під дією певного інгібітора прл умови, що / гемагтлютінірующая активність не руйнується при нагріванні і що гемагглю-тініл дійсно не має спорідненості до згаданого інгібітору. Було показано, що стабільність по відношенню до гуанідінгідрохлоріду (корелює з серотипом NA * (David-West, 1973).

  в) Активність ферменту. Низьку активність NA * штамів NWS і WSN, різко відрізняється від високої активності інших штамів вірусу, часто використовували як маркера (Burnet, Edney, 1951; Appleby, 1952; Burnet, Lind, 1955a, b; Hobson
  г) Кількість нейрамінідази, що вміщається вирионом. Існує ряд даних, що вказують на те, що є відмінність у кількостях NA *, синтезируемой в заражених клітинах і включається в вирион (Webster et al., 1968; Webster, Campbell, 1972; Palese, Schulman, 1974; Mowshowitz, Kilbourne, 1974) . Очевидно, це є генетично детермінованим властивістю штаму. Задовільного пояснення цього Спантеличує феномена з точки зору генетики в даний час немає.

  3. Морфологія віріона

  Препарати аллантоісной рідини штамів вірусу, що не були адаптовані до вирощування в порожнині ал-лантоіеа, часто містять головним чином ниткоподібні ві-

  Ріоні. Адаптація ж вирощуванню в порожнині аллантоиса супроводжується переходом від ниткоподібних форм ж сферичним. Однак початкова ниткоподібна морфологія може підтримуватися при пасажі в граничних розведеннях (Burnet, Lind, 1957а). Ці дані дозволяють-припускати, що морфологія є генетично обумовленої, схильною частою мутації від ниткоподібної форми до сферичної і що остання форма в порівнянні з першою володіє переважним виживанням в порожнині аллантоиса. Остаточне підтвердження того, що морфологія є генетично детермінованої, було отримано при проведенні дослідів по рекомбінації між сферичним штамом PR8 і нитковидним штамом вірусу А2, що призводить «до появи в потомстві серотипів: сферичного А2 і ниткоподібного PR8 (Kilbourne, Murphy, 1960). Морфологія не пов'язана ні з серотипом НА *, ні з серотипом NA *, але зміна форми від ниткоподібної до сферичної було асоційоване із збільшеною здатністю до росту в порожнині аллантоиса і більш високою латогеннимі для легких мишей (Kilbourne, Murphy, 1960; Kilbourne et al. , 1971). Невідомо, який вірусний білок (білки) визначає морфологію. На морфологію віріона, крім того, що вона обумовлена ??генетично, також впливають умови навколишнього середовища. Так, додавання алкоголята вітаміну А в порожнину аллантоиса призводить до утворення великої кількості ниткоподібних віріонів PR8, які були в основному сферичними в відсутність вітаміну A (Blough, 1964).

  Б. МАРКЕРИ, виявляється в результаті розмноження вірусу

  Для вірусу грипу інтенсивно застосовувалися і такі маркери, як коло господарів, патогенність або тип бляшок, але вони охарактеризовані менш повно, ніж маркери, засновані на фенотипах віріонів. Частково це обумовлено не зовсім повним розумінням біохімічних стадій реплікації вірусу, а частково - неминуче лолігенной природою цих маркерів (в тому сенсі, що багатоциклової ріст вірусу вимагає участі і координації всіх продуктів генома, що вже обговорювалося в розділі IA, 1д).

  1. Чутливість до клітини-господаря

  Вірус грипу може прикріплятися, проникати і ініціювати інфекцію в надзвичайно широкому колі господарів, у відношенні як видів тварин, так і культур клітин і органів. Однак у більшості випадків це призводить до абортивної інфекції, тобто РНК (як комплементарна, так і Віріонна) і білки синтезуються, але інфекційного вірусу

  продукується дуже мало (Schlesinger, 1950; Isaacs, Fulton, 1953; Henle et al., 1955; Lerner, Hodge, 1969; Haslam et al., 1970; Choppin, Pons, 1970; Sugiura, 1972). Причина абортивної інфекції, мабуть, проявляє себе у відносно пізній стадії реплікації вірусу. Невідомо, одна-й та ж чи стадія 'блокується у всіх системах вірус-«льотка, що призводять до абортивної інфекції. Абортивна інфекція, в якій міграція РНП-антигену з ядер в цитоплазму порушена (Franklin, Breitenfeld, 1959; Hills et al., 1960; Loffler et al., 1962; Ter Meulen, Love, 1967; Ghandi et al., 1971), і абортивна інфекція, в якій ця міграція здійснюється нормально (Sugiura et al., 1962; Fraser, 1967; Pristasova et al., 1967; Zavadova et al., 1968; Fedova, Tumova, 1968), можуть мати дефекти в різних стадіях ( см. також гол. 8).

  Різниця між продуктивною і абортивної інфекціями не абсолютно, бо навіть в абортивної інфекції утворюється іноді невелике число 'інфекційного вірусу, хоча воно і недостатньо для безперервного багатоциклового зростання (Chop-pin, Pons, 1970; Sugiura, Ueda, 1971).

  Маркери чутливості до клітини-господаря зазвичай виявляють за освітою на даних клітинах бляшок. Освіта бляішк, що вимагає продукції інфекційного вірусу, в кількостях, що перевищують певний рівень у кожному циклі многостадийного зростання, може бути занадто жорстким критерієм для маркування чутливості до клітини-господаря. Клони вірусів, які в процесі рекомбінації отримали ген (гени), необхідний для продуктивної інфекції, 'будуть давати різні кількості інфекційного потомства, але зазвичай менше, ніж продуктивний батьківський штам. Це, ймовірно, є причиною того, що ознака бляшкоутворення зустрічався істотно рідко в потомство, одержуваному від схрещування вірусів, що утворюють бляшки, з вірусами, що не утворять таких (Tobita, 1971). Порівняння виходів вірусу в перерахунку на клітку могло б дати більш відповідний критерій для маркування чутливості до клітини-господаря.

  При схрещуванні FPV зі штамами вірусу А2 1957 (H2N2) або зі штамом Гонконг (H3N2) для утворення бляшок на клітинах курячого ембріона і для вірулентності стосовно курячим ембріонам 'був необхідний, мабуть, НА * (але не NA * ) FPV (Tumova, Pereira, 1965; McCa-hon, Schild, 1971). FPV, інактивований ультрафіолетовим опроміненням або етіленнмінохіноном, реактивувати живими вірусами H2N2 або H3N2. За відсутності 'селекції в потомство зазвичай превалювали маркери живого батьківського штаму. Проте все клони, виділені з бляшок, утворених на клітинах курячого ембріона, мали НА * FPV. Навпаки, багато хто з цих клонів містили NA *

  типу N2, яке вказує на те, що NA * EPV може 'бути замінена на N2 без порушення здатності утворювати бляшки (McCahon, Schild, 1973).

  2. Патогенність

  Чи є вірус патогенним при цьому методі введення, залежить від його здатності продукувати інфекційне потомство в клітинах в місці інокуляції або навколо нього. Чутливість до клітини-господаря і патогенність розглядаються по суті як один і той же феномен на різних рівнях. З тієї ж самої причини, отже, критерій патогенності, виявля за сукупним зростанню вірусу, може бути таким же суворим, ч <ак і утворення бляшок в разі маркера чутливості до клітини-господаря. Це може також частково пояснити перерозподіл вірулентності (розділ IA, 1д). Раніше вже згадувалося про можливий зв'язок нейровн'рулентності з NA * NWS і про патогенності НА * для легких мишей або NWS або WSE при рекомбінації штаму Mel зі штамом NWS або WSE (розділ IA, 1в). Mayer та ін (1972) вивчали штами NWS, А2/Японія/305 і їх реком'бінанти (H0N2 і H2N1) за допомогою чутливого тесту на нейровірулентность - розмноження вірусу в мозку імуносупресованих мишей. Ні H0N2, ні H2N1 були вірулентними в тій же мірі, що і штам NWS, але обидва на відміну від батьківського штаму А2 'розмножувалися в мозку до певного рівня. Автори уклали, що нейровірулентность не була пов'язана ні з одним лише НА *, ні з однією лише NA *. На підставі цих даних у поєднанні з наведеними вище можна припустити відміну Н2 і НЗ від ПЗ та HI з точки зору потенції до нейровірулентность. Можна припустити також, що з НА ПЗ та HI асоційована неповна, але прихована нейровірулентность, тобто здатність до обмеженого розмноженню в мозку; об'єднання з NA * штаму NWS дозволяє вірулентності проявитися повністю. З іншого боку, НА * Н2 і НЗ не асоційовані з ростам. Введення NA * штаму NWS призводить лише до невеликого збільшення зростання 'вірусів.

  Наведений постулат пояснює, чому нейровірулентность була пов'язана з NA * штаму NWS при схрещуванні штамів Mel з NWS, тоді як ця нейровірулентность перебувала під подвійним генетичним контролем при схрещуванні штамів А2 і NWS. Підтвердженням цих положень є виявлена ??тими ж авторами здатність до зростання в мозку мишей штаму GAM (H1N1), хоча і в ограни-ченой ступеня, а також спостерігався теж обмежений, але цілком певне зростання штаму Mel в мозку дуже молодих мишей (Fraser, 1959b) .

  Більш складно йде справа з патогенноетью для легких мишей після інтранаеального введення вірусу. Більшість штамів вірусу грипу, ймовірно, наділене. Потенційної патогенноетью, TaiK як вони можуть бути легше адаптовані ж легким мишей, ніж до їх мозку. Зустрічалися випадки, коли вірулентність для легенів. Мишей була, мабуть, пов'язана з "НА * (MelxWSE або NWS, Burnet, Lind, 1952), з NA * (WSExCAM, Burnet, Lind, 1955; WSExSW, Burnet, Lind, 1956) або ні з тим, ні з іншим (A2XPR8, Kilbourne, Murphy, 1960; ГонконгXPR8, Kilbourne et al., 1971; А/Анг-лія/939/69хРК8, McCahon, Schild, 1972). Який з продуктів діяльності генів 'більше сприяє зростанню даного штаму вірусу в легенях мишей, може залежати від комбінації штамів вірусу.

  У розділі IVB, 1 вже згадувалося про зв'язок летальності для курячих ембріонів з НА * ВЧП при схрещуванні його з вірусом Гонконг.

  3. Здатність до зростання в порожнині аллантоиса курячих ембріонів

  4. Тип бляшок

  Розмір і морфологія бляшок - на вигляд дуже зручні маркери, але вони охарактеризовані неповно. Механізм і генетичні основи їх прояву абсолютно невідомі. Збільшена окр а шив а ем ость нейтральним червоним клітин, заражених певними штамами вірусу, що приводить до утворення бляшок з 'червоним кордоном (r-ознака; Su-giura, Kilbourne, 1966), обумовлена, як вважають, активацією лізосомальіих ферментів і, отже, особливостями ініціації цітопатічеекого дії (Allison, Malluc-ci, 1965).

  В. УМОВНО-летальністю МУТАЦІЇ

  а. Температурочувствітельной (ts) мутанти. Дані мутанти забезпечують дослідження, з генетики вірусів тварин найбільш зручними маркерами. Обговоренню ts-му-Танта відведено в подальших розділах так багато місця, що далі будуть відзначені лише ті особливості ts-мутантів, які різко відрізняють їх від інших маркерів.

  1. Геном ts-мутантів може бути ідентичним геному ві

  руса дикого типу, за винятком одного локусу. Для таких

  мутантів питання про сумісність генів або про полігенною природі маркера не повинен виникати.

  2. Мутації можуть мати місце, принаймні теорети

  тично, у всіх генах. Отже, використання ts-мутаа

  тов може значно розширити межі генетичного

  аналізу, можливо, до розмірів цілого генома.

  3. ts-мутанти можуть забезпечити сильне дозвіл, якщо

  вони ревертіруют досить рідко і не є текучими.

  Якщо продуктивна і абортивна інфекції розрізняються за

  виходу вірусу приблизно в 100 разів (Sugiura et al., 1969;

  Choppin, Pons, 1970), то деякі ts-мутанти виявляють

  більш ніж 106-кратне відміну при роздільній і нерозривно

  шує температурах.

  б. Мутанти, чутливі до клітини-господаря. Мутанти, чутливі до клітини-господаря, для вірусу грипу виявлені не 'були. Їх виділяли з вірусу везикулярного стоматиту, який у багатьох відношеннях нагадує вірус грипу (Simpson, Obijeski, 1974). У світлі можливості участі геному клітини-господаря в реплікації вірусу (Borland, Mahy, 1968; Mahy et al., 1972) і помітною залежності успішного дозрівання від клітини-хазяїна, ino мабуть, заслуговує заохочення спроба відшукати аналогічні мутанти і для вірусу грипу.

  Y. ГЕНЕТИЧНІ Взаємодія

  А. генетичної рекомбінації

  1. Рекомбінація вірусів грипу типу А

  Для того щоб вивчати генетичну рекомбінацію з кількісної точки зору, в експериментах повинні бути виконані наступні умови.

  1. Змішана інфекція повинна проводитися в умовах

  приблизно рівною реплікації обох вірусних штамів.

  2. Всі клітини, присутні в системі, повинні бути

  заражені одночасно обома вірусними штамами. Іно-

  кулірувальні вірус повинен; бути повністю, наскільки це

  можливо, видалений до появи потомственого вірусу.

  3. Потомствений вірус повинен бути проаналізований

  на такій системі хазяйських клітин, в якій всі инфекци

  ційні частинки потомственого вірусу можуть бути зарегіст

  рировать.

  4. Маркери повинні бути чітко охарактеризовані і іден

  тіфіціровани з повною визначеністю.

  Введення вірусу у високій концентрації, необхідної для одночасного зараження всіх клітин вірусами обох типів, неминуче призводить в більшій чи меншій мірі

  до появи феномена фон-Магнуса. Отже, інтерпретувати результати необхідно завжди, виходячи з. Припущення, що інфекційний вірус генотипически відображає (принаймні відносно застосовуваних маркерів) тотальний потомствений вірус, що складається головним чином з неповного вірусу.

  Серед досліджень рекомбінацій, 'коли використовують природні штами вірусу, приблизно у відповідності з викладеними вимогами, були проведені експерименти, описані Tobita (1971, 1972). Змішану інфекцію проводили на лінії клітин кон'юнктиви людини, «лон 1-5С-4 (Kilbourne, 1969), штамами NWS (H0N1) і Гонконг (H3N2),. Які приблизно з рівною ефективністю утворювали на цих клітинах бляшки. Клони потомственого вірусу випадково виділяли з бляшок, утворених на тих же клітинах за відсутності селектірующего тиску; у них визначали сіро-ТЙП НА *-і NA *. Дані про частоту появи чотирьох можливих генотипів серед 191 потомственого клона, отримані в чотирьох окремих дослідах, наведено в табл. 22.

  Отримані таким чином результати ясно вказують на існування або неіснування рекомбінаційних подій серед мутантів. Між мутантами з відносно низьким рівнем реверсій і з малим ступенем плинності рекомбінації або відбуваються з частотою, мінливої ??від 2 до 33%, або не визначаються (не перевищують 0,02%) - Мутанти можуть бути розбиті на групи, або кластери, в межах яких не відбувається рекомбінація. Мається на увазі, що така картина рекомбінації має місце головним чином у результаті обміну фрагментами геному. Результати, отримані Mackenzie (1970), які він вважав що вказують на лінійність карти вірусного генома, також сумісні з наведеною схемою. Вони показують, що мутанти розбиваються на п'ять кластерів, усередині яких рекомбінацій не відбувається (за деякими винятками), але між якими виявляються рекомбінації з частотою більше 2%.

  Існування внутрігенних рекомбінацій, що йдуть по механізму кросинговеру, в даний час не може бути повністю виключено. Але якщо вони відбуваються так само, як в поліовірусу (Cooper, 1969; Cooper et al., 1971), то при порівнянні розмірів генома поліовірусу і фрагментів РНК вірусу грипу можна отримати, що частота таких рекомбінацій не перевищує 0,3%. Рекомбінації такого порядку

  повинні б легко виявлятися при відповідному підборі its-мутантів. ) Поки дані, що припускають існування внутрігенних рекомбінацій, відсутні.

  Sugiura і співавт. (1972) не виявлено розбіжностей між даними по рекомбінації і по 'комплементації. Це підтримує припущення,-що (Кожен субгеномний фрагмент є моноцістрО'ННим (Skehel, 1972). З іншого, боку, Simpson і Hirst (1968), а також С. Г. Маркушин. Та Ю. 3. Гендон (1973) описали певні комплементу-рующие пари мутантів, рекомбінація між якими відсутня. Різночитання між рекомбинацией і комплементації, що припускають або внутрігенних комплементації,, або присутність двох генів в одному фрагменті РНК, повинні бути дозволені у 'майбутніх дослідженнях.

  Нерідко частота рекомбінації помітно змінюється від досвіду до досвіду. Для однієї і тієї ж пари мутантів при імовірно однакових умовах експериментів відмінності можуть бути в 30 разів (Mackenzie, 1970; Hirst, 1973) або в кілька разів (Sugiura et al., 1972). Згідно з даними Mackenzie (1970), додавання до 'культуральної рідини після адсорбції вірусу RDE стабілізує частоту рекомбінацій .. Він також ввів в усі досліди одне і те ж стандартне схрещування і, використовуючи RDE і співвідносячи спостережувану частоту рекомбінації певної пари з аналогічною величиною, отриманою для стандартного схрещування, зміг звести розкид даних «мінімуму. Досягнута таким чином відтворюваність дозволила Mackenzie 'продемонструвати аддитивность частоти рекомбінації між низкою мутантів і сконструювати лінійно організовану карту геному. Однак та ж техніка не мала успіху в системі, використаної в роботі Hirst (1973). В даний час остаточно відповісти на питання, лінійно чи ні організовані гени, - не можна.

  Іншою істотною, постійно спостережуваної особливістю рекомбінації є те, що множинність інфекції може бути в значних межах знижена без помітного зменшення частоти рекомбінації (Simpson, Hirst, 1968; Mackenzie, 1970; Sugiura et al., 1972; Hirst, 1973). При множинності кожного вірусу, рівний '/ ю БОЮ / кліть-ку, коли тільки 5% всіх заражених клітин отримують одразу обидва віруси, частота рекомбінації повинна падати до V20 від максимального рівня. Проте насправді вона зменшується менш ніж 'удвічі (Sugiura et al., 1972). Це можна пояснити лише виходячи з припущення про присутність частинок, які не є інфекційними в звичайному сенсі, але здатні приводити до появи інфекційних рекомбі-Нант 'внаслідок генетичного взаємодії з іншим вірусом (розділ VA, 3).

  Рекомбінація між штамами Lee і Mil вірусу грипу типу В 'була показана в роботах Perry і Burnet (1953), а також Perry і співавт. (1954). Вони отримали рекомбінанти, які містили НА * типу Mil, що виявляються за серологической специфічності, термостабільності і спорідненості до рецептора, але успадковували від штаму Lee патогенність для легких мишей і реципрокні рекамбцнанти, авірулент-ні Lee.

  Tobita і Kilbourne (1974) заражали «льотки курячого ембріона штамом Lee і штамом В/Массачусетс/1/71, антиген-'але відмінним від Lee як по НА *, так і ло NA *, і навмання виділяли бляшки, які розвивалися в відсутність селектірующего тиску. У клонах визначали оеротіпи НА * і NA *. Вивчений 31 клон розбили на наступні типи:

  Hi.ee - NLee 3 клона

  Hjviass - NMass 8 КЛОНІВ

  HLee - NMass 2 клоном

  Hjviass - NLee. .18 Клонів.

  Двадцять із 31 клона (64%) були рекомбінантов за двома поверхневих антигенів. Таким чином, віруси грипу типу В не відрізняються від вірусів грипу типу А відносно високої частоти рекомбінації.

  Незважаючи на ефективну рекомбінацію вірусів всередині як типу А, так і типу В, межтіпових рекомбінантов отримати не вдається.

  3. Механізм рекомбінації

  Відомі зараз особливості рекомбінації вірусу грипу мають разючу подібність з особливостями рекомбінації реовірусів. Статистичний аналіз частоти рекомбінації між ts-мутантами реовірусів свідчить на користь випадкового групування елементів геному. У разі вірусу грипу переконливі дані для такого висновку поки відсутні.

  Питання про те, як здійснюється рекомбінація, є істотним для з'ясування Луті, по 'якому відбувається складання фрагментів РНК, а також для з'ясування питання про існування чи відсутності будь-якого спрямованого процесу, що забезпечує зборку всіх фрагментів РНК-Згідно з однією гіпотезою, збірка є суто випадковим процесом (Hirst, 1962, 1973). При цьому поряд з частинками, що містять повний набір фрагментів РНК, неминуче повинно продукуватися велике число дефектних часток. Такі дефектні частинки, потрапляючи в одну і ту ж клітку,

  повинні комплементіровать один з одним, продукуючи інфекційний потомствений вірус. Згідно з даними Hirst (197ц), а також Hirst і Pons (1973), якщо суміш двох штамів вірусу три 'відносно високої концентрації витримують протягом певного часу, а потім розводять і наносять на клітини, частка клітин, що зазнали подвійної інфекції, виявляється набагато вище , ніж у тому випадку, якщо суміш розводять відразу ж після злиття двох вірусів або обидва віруси розбавляють перед змішуванням. Після досить тривалого періоду інкубації при 4 ° С частка клітин, що зазнали подвійної інфекції, серед загального числа заражених клітин стає постійною, незважаючи на концентрацію вводяться вірусів, ніби двічі інфіковані клітини утворюються в результаті одноударний, а не двох-ударного процесу, чого можна було б очікувати для клітин, які отримують дві незалежно инфицирующие частинки. Hirst припустив, що подвійна інфекція, що характеризується одяоударним процесом, 'інфікується предобразован змішаними агрегатами. Якщо агрегат, що включає вірусні частки з різними відсутніми фрагментами РНК, входить в клітку, то завдяки топографічної близькості таких частинок шанси на успішний початок інфекції повинні істотно зрости. Такий механізм повинен підвищувати шанси на рекомбінацію 'як в дослідах по змішаній інфекції, так і в природі. Якщо утворення змішаних агрегатів є універсальним феноменом, частота рекомбінації не повинна бути настільки значною, як спочатку передбачалося, оскільки важко відрізнити змішані агрегати від істинних рекомбінантов. Більш того, інтенсивна реактивация випадково дефектних вірусних частинок в процесі утворення змішаних агрегатів повинна б зробити роль інфекційних віріонів грипу сумнівною.

  Випадкова збірка фрагментів РНК могла б забезпечувати вірусу перевагу завдяки сильно збільшеним шансам на рекомбінацію, але, з іншого боку, це може виявитися невигідним, тому що занадто мала вірогідність того, що згрупує повний набір фрагментів. Можливим поясненням спостерігається частоти рекомбінації є постулювати вище освіту дефектними вірусними частками змішаних агрегатів. Compans і співавт. (1970) запропонували також модель, яка постулює упаковку в 'віряон більшого числа фрагментів РНК, ніж в основному наборі. Включення надлишкових двох або трьох фрагментів РНК на частку істотно збільшує частку повних часток.

  З іншого боку, Pons (1970). Припустив, що (фрагменти РНК утримуються один з одним за допомогою білкового тяжа, що складається з субодиниць РНП, і що знову синтезована РНК включається в РНП шляхом зміщення з цього тяжа матричної РНК-Біологічна активність РНП, але НЕ РНК (Hirst, Pons, 1972), і тісний зв'язок РНП з РНК-синтезуючої активністю (Compans, Caliguiri, 1973) вказують на те, що у реплікації РНК важлива роль належить саме РНП, а не вільної РНК-Ця гіпотеза,, однак , повинна передбачати лінійне розташування фрагментів геному, для чого, якщо не вважати роботу Mackenzie (1970), генетичні дослідження поки не в змозі надати відповідних даних.

  Б. МНОЖИННА РЕАКТИВАЦІЯ І КРОС-РЕАКТИВАЦІЯ

  І множинна реактивация, і крос-реактивация є генетичними рекомбінаціями, що включають вірус,, який втратив інфекційність в результаті ушкодження своїй РНК-Множинна реактивация має місце у випадку інактивованої вірусу одного і того ж генотипу, коли в множинно інфікованій клітині присутній щонайменше один повний набір інтактних фрагментів геному. Barry (1961) в дослідах по множинної реактивації вірусів грипу, інактивованих ультрафіолетом, порівнював експериментально отримані криві типу доза - відповідь стосовно множинності зараження і виходу вірусу з теоретичними кривими, побудованими, згідно-рекомбинационной моделі Luria і Dulbecco (1949), «а підставі припущення про різний числі радіаційно-чув-ствительность одиниць. Більший збіг спостерігалося з кривою, жогда припускали, що геном складається з шести радіаційної-чувствттельних одиниць. Спокусливо прирівняти радіаційно-чутливі одиниці до фрагментів РНК-Однак, оскільки на вихід вірусу може впливати феномен фон-Магнуса або інтерференція, неминучі-в таких експериментах, він може неточно відображати число клітин, що продукують вірус. Бажано, щоб множинна реактивация знову була кількісно розглянута із застосуванням удосконалених методів, таких, як аналіз інфекційних центрів абоімунофлюоресцентний підрахунок інфікованих клітин.

  Відсутність множинної реактивації між неповними вірусами (феномен фон-Магнуса) можна пояснити тим, що-

  у них немає загальної частини генома (Rott, Scholtissek, 1963). Елек-трофоретіческій аналіз РНК виявив відсутність самого больцгого фрагмента РНК в. Препаратах вірусу фон-Магнуса (Pons, Hirst, 1969; Choppin, Pons, 1970). Однак, мабуть, поки що передчасно робити висновок про те, що саме цей фрагмент РНК являє собою загублену частина1 генома у вірусі фон-Магнуса, оскільки кількісна кореляція між зникненням фрагмента РНК і ступенем «неповноти» вірусу відсутня. Профіль РНК залишається незміненим до тих пір, поки відношення БОЮ до одиниць тсмагглютінаціі не впаде до 1 :/ 3О і менше.

  Крос-реактивация - це рекомбінація між инактиви-ро'ванним вірусом і живим вірусом іншого генотипу. Ця взаємодія інтенсивно використовують для виділення реком-бннантов, оскільки воно пропонує зручний шлях відбору потрібних їх типів за рахунок сильно пригніченого виходу інак-тівлрованного батьківського вірусу (Kilbourne, Murphy, I960), особливо в поєднанні з 'використанням для придушення живого батьківського штаму селектірующіх клітин -господарів. Немає даних про там, що інактивація сама по собі істотно змінює механізм рекомбінації або збільшує рівень рекомбінації. Отримані типи рекомбінан-тов є однаковими незалежно від того, чи був один з батьківських штамів инактивирован чи ні (McCahon, Schild, 1971).

  Крос-реактивацию використовували для встановлення частки геному, залученої в прояв певної функції. Шляхом порівняння рівня інактивації інфекційності з рівнем бляшкообразующіх здатності Sugiura і Ueda (1971) припустили, що для утворення бляшок на клітинах FL штаму NWS потрібно близько 7з геному. Аналогічні досліди, проведені McCahon і Schild (1971), привели до висновку, що 50% генома залучені в функцію бляш-кообразованія у FPV на клітинах курячого ембріона. Ці величини, ймовірно, завищені з точки зору можливості того, що утворення бляшок є строгим критерієм здатності IK зростанню в певних клітинах, як вже обговорювалося в розділі IVB, 1.

  В. комплементації

  У табл. 23 наведено типовий приклад комплементації між ts-мутантами, тоді як у табл. 24 вказується на відсутність комплементації у разі іншої пари мутантів. Мутанти, що відносяться до різних груп, комплементу-руют один з одним при змішаній інфекції з рівнем комплементації, що змінюються від 21 до 17 900 (Sugiura et al., 1972). Вихід вірусу при необмежувальні температурі, появ-

  ляющие в результаті комплементації, зазвичай перевищує

  10% від виходу вірусу при роздільній температурі. Шля1

  деяких пар, однак, (отримано значно менший вихід

  навіть за наявності як комплементації, так і рекомбінації,

  що, мабуть, обумовлено взаємної інтерференцією му

  Танта при необмежувальні температурі. j

  Важливою характерною особливістю комплементації,. на противагу рекомбінації, є те, що більша частина потомственого вірусу, продуцируемого при необмежувальні температурі, все ще зберігає вихідне ts-властивість (див. табл. 23). Разом з (комплементації при необмежувальні температурі має місце я рекомбінація, але. Коли 1В взаємодія залучаються мутанти, дефектні в ранній стадії реплікації вірусу,-комплементація є необхідною умовою для утворення рекомбі-Нанті.

  Комплементації між штамами вірусу, існуючими в природі, інтенсивно не дослідили. Виділення неней-ротротгаого штаму Mel з мозку миші, зараженої сумішшю штамів NWS і Mel, могло б представляти собою приклад - комплементації (Fraser, 1959c).

  V!. Фенотипическому ЗМІШУВАННЯ І ГЕТЕРОЗІГОЗІС

  Фенотіліческое змішання відбувається при будь-якій комбінації вірусів грипу незалежно від їх генетичної сумісності, наприклад між вірусами грипу А і В (Gotlieb, Hirst, 1954) і навіть між вірусами грипу та парамяксо-вірусом (Granoff, Hirst, 1954). У всіх випадках, в яких було показано фенотипическое змішання, цей феномен спостерігався для НА *, але немає причин сумніватися в можливості фенотнпнчеакого змішання NA *. Лише невелика кількість нових даних або нова їх інтерпретація були додані до того, що описано в розділі I. Зробимо лише (Короткі зауваження по методичним проблемам, що належать до фенотіпіче-ському змішання. Майже все потомство вірусу, виробленого 'змішано інфікованої кліткою, є фенотіліческі змішаним або відчуває подвійну нейтралізацію при схрещуванні, що включає два антигенно ВІДМІННІ штаму вірусу. Відповідно / використання антисироватки для цілей селекції певного серотипу прибирає основну масу рекомбінантов. Бажано, щоб додавання анти-сьгвороткі було затримано до тих пір, поки всі фенотіпіче-скі змішані вірусні частки не проникнуть в «льотки при наступному пасажі, 'особливо коли хочуть отримати інтенсивне виділення рекомбінантов або коли рекомбінацію вивчають кількісно.

  Незважаючи на важливе значення, що надається в ранньому періо'де досліджень з генетики гетерозиготі як джерелам! рекомбінантов (Hirst, Gotlieb, 1955) (розділ IA, 2с), переконливі дані про їх існування відсутні. Зараз зрозуміло, що «гетерозиготи», виявлялися в той час, в більшості випадків були змішаними агрегатами, що містять вірусні частки двох різних генотипів. По-перше, 'більшість гетерозигот було, ймовірно, діллоіда-ми, оскільки вони були' гетерозиготними за кількома ознаками (Hirst, Gotlieb, 1955). По-друге, істотна частина частинок у вірусному препараті знаходиться у вигляді агрегатів (Hirst, 1973; Hirst, Pons, 1973). Якщо гетерозигота і існує у вигляді, що не представляє собою змішаного агрегату, то нині цього не можна довести, так як немає методу, прийнятного для експериментального поділу двох форм: однією, яка містить два різних внутрішніх генома, і другий, що складається з двох зовні роздільних, , але тісно пов'язаних між собою частинок. Або гетерозиготи,, або змішані агрегати можуть бути основним джерелом рекомбінації за певних експериментальних умовах, але вони, мабуть, не відповідальні за генерацію ре-Комбінатна у звичайних змішаних інфекціях, і частка їх у змішаному врожаї вірусу невелика. Дослідження окремих клонів, виділених з змішаного врожаю після зараження вірусами NWS і Гонконг, про який вже згадувалося в розділі VA, 1 (Tobita, 1971, 1972), показало, що тільки 3 клона з 194 давали зростання двох різних генотипів при наступному пасажі. Оскільки всі ці клони безпосередньо досліджували на Серота НА * і NA * методом бляшок без проміжних пасажів, присутність вірусів двоїстого типу легко могло бути визначено.

  VII. ВИВЧЕННЯ ФУНКЦІЇ ГЕНОВ З ДОПОМОГОЮ TS-МУТАНТІВ

  Умовно-летальні мутанти бактеріофага були витончено використані при з'ясуванні біохімічних стадій вірусної реплікації (Epstein et al., 1963). Аналогічні дослідження щодо вірусу грипу були розпочаті лише нещодавно. Тридцять чотири ts-мутанта вірусу WSN, отримані Su-giura і співавт. (1972, 1975), були розбиті на сім неперекривающіхся рекомбінаційно-комплементаціонних груп (I-VII) на підставі наявності чи відсутності рекомбінації і комплементації при змішаних парних інфекціях. Мутанти, що належать до груп I, II, III і V, проявляють відсутність синтезу РНК при необмежувальні температурі а присутності актиноміцину D і найбільш імовірно, що вони є дефектними по раннім функціям, які належать чи-

  бо до транскрипції, або до реплікації РНК. Мутанти / груп IV, VI і VII синтезують при тих же умовах помітні кількості РНК,-що перевищують 10% від синтезу в 'Контролі. Вони, ймовірно, являють собою мутанти, дефектні по пізніх функціям (Sugiura et al., 1975). Два мутанта з групи IV, вивчені до теперішнього часу, не продукують ні функціонально-активного НА *, ні NA *, хоча за даними електрофорезу все поліпелтіди синтезуються і, більше того, дослідження в електронному мікроскопі виявляють відбруньковування вірусних частинок яри необмежувальні температурі. Термолабнльность NA * віріонів, вирощених при роздільній температурі, припускає, що причини дефектності мутантів цієї групи укладені в NA * (Palese et al., 1974). Для мутантів групи VI, з іншого боку, термолабілен-ність їх НА * і їх здатність давати збільшення виходу НО-містять 1 & +-рекомбінантов при схрещуванні з НЗ-со-тримає вірусом припускають наявність пошкоджень в НА * (Ueda, Tobita, Sugiura, неопубліковані дані).

  Найбільшу трудність для характеристики мутантів представляє крайня варіабельність від мутанта до мутанту в межах однієї і тієї ж групи таких фенотипічних проявів,. Як синтез РНК або поліпептидів і продукція РНП, НА * або NA *. Це особливо помітно для мутантів, які мають ушкодження у ранніх стадіях репродукції. Загально-прийняте пояснення полягає в тому, що на фенотипічні прояви, як уже вказувалося, сильний вплив робить плинність мутантів, і іноді невелика кількість тРНК, синтезованих завдяки такій плинності, забезпечує майже нормальний прояв певних фізіологічних функцій. Зроблені ранні укладення засновані, отже, на характеристиці таких мутантів з кожної групи, які мають найменшу, де це можливо, плинність.

  Чотирнадцять ts-мутантів ВЧП, виділених Ю. 3. Генда-ном і співавт. (1973в), були розбиті. На чотири рекомбіна-ційних або на п'ять комплементаціонних груп. Рекомбінація між комплементаціоннимі групами А і В відсутня. КомплементаЦ'шнная група D є, ймовірно, дефектної в ранній стадії реплікації вірусу. Один мутант з цієї групи був РНК "'в присутності актиноміцину D і не синтезував скільки-небудь помітних кількостей продуктів діяльності генів. Його вирион-асоційована транскриптаза була значно менш активною при необмежувальні температурі, ніж при роздільній. Мутант з групи Е володів протилежними властивостями, тобто був здатний синтезувати РНК, а також поліпептиди, включаючи функціонально-активні НА та NA, а також РНП в кількостях, 'порівнянні з такими в дикому типі. ts-My-танто WSN, виділені Mackenzie (1970), а також Mackenzie і Dimmock (1973), розподіляються в п'яти або, можливо, шести групах, коли їх найменш охарактеризовані мутанти ts-З і ts-8 розглядаються входять кожен в окрему групу.

  Близько 80 ts-мутантів WSN, вивчених групою під керівництвом Hirst (Simpson, Hirst, 1968; Hirst, Pons, 1972; Hirst, 1973), були розподілені у восьми комплементаціонно-рекомбннаціонних групах.

  Таким чином, число виявлених груп все більше наближається до передбачуваного числа генів. Детальна характеристика цих мутантів повинна виявити невідомі поки функції кожного гена і (комплексні взаємодії їх продуктів. Тоді генетика вірусу грипу, безсумнівно, буде обговорюватися з абсолютно іншої точки зору.

  Крім використання для цілей генетичного аналізу, ts-мутаяти можуть служити кандидатами в аттенунрованние живі вірусні вакцини внаслідок їх значно зниженою патогенності як для тварин, так і для людини (Mackenzie, 1969; Mills, Chanock, 1971; Murphy et al., 1972; Ghendon et al., 1973a). Мутант, про який відомо, що він несе: мутацяю в частині генома, відмінної від тієї, яка кодує НА * або NA *, міг би бути корисним в якості потенційного донора температурної чутливості для будь-якого майбутнього епідемічного штаму.

  VIII. ВИСНОВОК

  В даний час більшість експериментальних даних сумісно з положенням про те, що геном складається з субгеномних фрагментів, транскрипти яких функціонують як моноцістронние інформаційні РНК, і що ці фрагменти в процесі складання знову групуються для утворення зрілого віріона. Але точний механізм оборки ще має бути з'ясоване, щоб визначити, чи є таке угрупування випадковим процесом або при цьому діє механізм, що забезпечує ефективне дозрівання. До інших, погано поки зрозумілим, явищам слід, мабуть, віднести генетично контрольоване, плавно змінюється вираз нейрамінідазной гена, як це спостерігається для рекомбінантов Х7 в порівнянні з Х7 (F1), і багато інших питань. 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Генетика вірусу грипу"
  1.  Кільбурн Е.Д.. Віруси грипу та грип (1978), 1978
      Книга присвячена огляду різноманітних вірусів грипу, їх культивування, біохімії і особливостям молекулярного пристрою. Зміст: Віруси грипу та грип. Структура вірусу грипу. Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін. Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу. РНК вірусів
  2.  Віруси грипу та грип
      Е. Д. Кільбурн (Е. D. KILBOURNE) I. ВСТУП. ГРИП - ЗАХВОРЮВАННЯ З Незмінних симптоматики, викликає Змінюється ВІРУСОМ Величезний інтерес, який притягається до сучасної вірусології до грипу і вірусів, відповідальним за його виникнення, вимагає пояснення, якщо врахувати ординарний характер симптоматики цього, зазвичай дуже помірного, інфекційного захворювання дихальних шляхів
  3.  Культивування вірусів грипу людини в лабораторних умовах, коло господарів серед лабораторних тварин і виділення вірусу з клінічного матеріалу
      В. Р. Даудл і Г. С. ШИЛД (WR DOWDLE, G. С. SCHILD) I. ВСТУП Вперше пасаж вірусу грипу в експерименті був здійснений на початку століття при роботі з ВЧП, проте до 1955 р. він не'бил віднесений до вірусів грипу (Schafer, 1955). У 1931 р. Shope пасеровані «. Класичний» грип на свинях шляхом інтраназального введення їм фільтрату виділень з респіраторних шляхів. Перші дані про
  4.  ІСТОРІЯ ВІРУСОЛОГІЇ.
      Перші згадки про вірусних хворобах людей і тварин зустрічаються в дійшли до нас письмових джерелах древніх народів. У них, зокрема, містяться відомості про епізоотій сказу у вовків, шакалів і собак і поліомієліті в Стародавньому Єгипті (II-III тис. років до н. Е..). Про натуральної віспи було відомо в Китаї за тисячу років до нашої ери. Давню історію має також жовта лихоманка, на
  5.  3. ПИТАННЯ ДО ІСПИТУ
      Розділ 1. Загальна частина Морфологія мікроорганізмів 1. Основні принципи класифікації мікробів. 2. Морфологічні та тинкторіальні властивості бактерій. Методи забарвлення. 3. Структура та хімічний склад бактеріальної клітини. Особливості будови грампозитивних і грамнегативних бактерій. 4. Морфологія грибів. Принципи класифікації. 5. Морфологія найпростіших. Принципи
  6.  Методи обстеження при жіночому безплідді
      Величезне значення мають дані анамнезу. З анамнезу лікар дізнається про особливості розвитку пацієнтки, віці її батьків, захворюваннях, перенесених у дитинстві нею самою та її батьками. Важливими можуть стати дані про захворювання в сім'ї туберкульозом, наявності новоутворень, психічних захворювань. Зловживання курінням і алкоголем самої пацієнтки або ж її батьками також може мати
  7.  ГОЛОВНИЙ КОМПЛЕКС ГЕНОВ гістосумісності
      Чарлз Б. Карпентер (Charles В. Carpenter) Антигени, що забезпечують внутрішньовидові відмінності особин, позначаються як аллоантігени, а коли вони включаються в процес відторгнення алогенних тканинних трансплантатів, то набувають назву антигенів тканинної сумісності (гістосумісності). Еволюція закріпила одиничний ділянку тісно зчеплених генів гістосумісності, продукти яких на
  8.  ПИТАННЯ ДО ІСПИТУ
      Розділ 1. Загальна частина Морфологія мікроорганізмів 1. Основні принципи класифікації мікробів. 2. Морфологічні та тинкторіальні властивості бактерій. Методи забарвлення. 3. Структура та хімічний склад бактеріальної клітини. Особливості будови грампозитивних і грамнегативних бактерій. 4. Морфологія грибів. Принципи класифікації. 5. Морфологія найпростіших. Принципи
  9. В
      + + + Вагіна штучна (лат. vagina - піхва), прилад для отримання сперми від виробників сільськогосподарських тварин. Метод застосування В. і. заснований на використанні подразників статевого члена, замінюють природні подразники піхви самки, для нормального прояви рефлексу еякуляції. Такими подразниками в В. і. служать певна температура (40-42 {{?}} C) її стінок,
  10. Г
      + + + Габітус (лат. habitus - зовнішність, зовнішність), зовнішній вигляд тварини в момент дослідження. Визначається сукупністю зовнішніх ознак, що характеризують статура, вгодованість, положення тіла, темперамент і конституцію. Розрізняють статура (будова кістяка і ступінь розвитку мускулатури): сильне, середнє, слабке. Вгодованість може бути гарною, задовільною,
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...