загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Гель-електрофорез

Електрофоретичне поділ ДНК в агарозному гелі.

Поділ ДНК проводили в горизонтальному агарозному гелі в 1 ТАЕ у присутності бромистого етидію. Геномну ДНК після обробки метил-чутливими рестриктазами і плазмідну ДНК фракціонували в 0.8% агарозе; фрагменти ДНК, отримані в результаті ПЛР, в залежності від розміру поділяли в 1-3% гелі. Відповідна кількість агарози ("Sigma", США; "Serva", США) і буфера ТАЕ нагрівали в дистильованої воді до повного розплавлення агарози. Після цього розчин агарози охолоджували до 50оС і додавали бромистий етидій до кінцевої концентрації 0.5 мкг / мл, перемішували і заливали в кювету для гелю. Зразки досліджуваної і маркерною ДНК наносили на гель, попередньо змішавши з буфером для нанесення (9:1, о / о). В якості ДНК-маркера застосовували X Hind III, X PstI і 100bp (табл. 3). Електрофорез геномної ДНК проводили при напруженості електричного поля

Таблиця 3.

ДНК-маркери молекулярної ваги

.



3-4 В / см протягом ночі. Надалі Фракціоновані геномную ДНК переносили на нейлонову мембрану і використовували в блот-гібридизації. Електрофорез плазмідної ДНК і продуктів ПЛР проводили при напруженості електричного поля 10-15 В / см протягом 30-45 хв. ДНК в гелі реєстрували по флуоресценції в що проходить ультрафіолеті з довжиною хвиль від 240 нм до 360 нм. Результати протоколювати за допомогою фотографування гелю або системи Gel Imagertm.

Электрофоретическоеразделение РНК в агарозному гелі. Поділ РНК проводили в горизонтальному 0.8% агарозному гелі в 2 BE в присутності формальдегіду і бромистого етидію. Для отримання гелю відповідну кількість агарози ("Sigma", США) і буфера ВЕ нагрівали в невеликій кількості дистильованої води до повного розплавлення агарози. Потім додавали 1/6 кінцевого обсягу 37% розчину

формальдегіду, бромистий етидій до кінцевої концентрації 0.2 мкг / мл і дистильовану воду, перемішували і заливали в кювету для гелю. Перед нанесенням зразки досліджуваної РНК переосаждалі з використанням 3М ацетату натрію - 96% етанолу (див. п. 13) і розчиняли в 20 мкл суміші, що містить 50% формамід, 2 BE буфер, 7% формальдегід і бідистильовану воду. Потім проби інкубували при 55оС протягом 15 хв, охолоджували у крижаній бані протягом 5 хв і наносили на гель, попередньо змішавши з буфером для нанесення (9:1, о / о). Електрофорез проводили при напруженості електричного поля 3-4 В / см протягом 3-4 ч. Результати протоколювати за допомогою фотографування гелю. Надалі Фракціоновані РНК переносили на нітроцелюлозну мембрану і використовували в блот-гібридизації.

Електрофорез ПЛР-ампліфікованої ДНК в денатуруються

поліакриламідному гелі.

Для проведення електрофорезу в ПААГ ми використовували електрофоретичний прилад Sequi-Gen ("Bio-Rad", США). В якості електрофоретичного буфера використовували 1 ТВЕ.

Для зв'язування гелю зі склом, одне із стекол обробляли "кислим" силаном (acid activated silane). Інше скло силіконізірованной діметілхлорсіланом (repel silane). Для отримання гелю готували 75 мл

суміші, наступного складу: 9.375 мл 40% розчину акриламід-бісакріламід

х

(співвідношення акриламід-бісакріламід 19:1), 15 мл 5 ТВЕ, 31.5 г сечовини і дистильована вода до необхідного обсягу. Потім додавали 300 мкл ПСА і 60 мкл TEMED, ретельно перемішували і заливали в прилад для полімеризації. Перед нанесенням проб на гель проводили префорез при напруженості електричного поля 45 В / см протягом 1 ч.

Проби для електрофорезу в ПААГ готували наступним чином: 2 мкл досліджуваного продукту ПЛР змішували з 6 мкл буфера для нанесення в ПААГ. Далі проби прогрівали при 100оС протягом 5 хв, охолоджували у крижаній бані, брали аліквоту 4 мкл і наносили на гель. Електрофорез проводили протягом 4-6 год при 50оС і напруженості електричного поля 40-50 В / см (залежно від температури гелю).

По закінченні електрофорезу гель залишався на склі, обробленим "кислим" силаном і його фіксували в 10% оцтової кислоті протягом 20 хв. Після фіксації гель відмивали 3 рази дистильованою водою по 2 хв кожний раз. Потім проводили забарвлення розчином 1 для сріблення протягом 30 хв, промивали 20 сек дистильованою водою і проявляли розчином 2 для сріблення протягом 1-5 хв (до появи забарвлення ДНК). Потім реакцію зупиняли фіксацією в 10% оцтової кислоті протягом 5 хв і промивали водою. Результати протоколювати за допомогою сканера Mustek 1200SP.
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
Інформація, релевантна " Гель-електрофорез "
  1. ВРОДЖЕНІ ПОРУШЕННЯ МЕТАБОЛІЗМУ (ОГЛЯД)
    Леон Нею Розенберг (Дущт У. Кщиутіукп) Взаємодія генів і навколишнього середовища. Під поняттям «обмін речовин» розуміють усі процеси утворення (анаболізм) і руйнування (катаболізм) живої матерії. Вони починаються з самих ранніх хімічних реакцій, що призводять до утворення сперматозоїда і яйцеклітини, тривають в періоди запліднення, росту, дозрівання і старіння і неминуче
  2. СПАДКОВІ хвороби сполучної тканини
    Дарвін Дж. Прокоп (Darwin J. Prockop) Спадкові хвороби сполучної тканини відносяться до найбільш поширених генетичним синдромам. До них відносять найчастіше недосконалий остеогенез, синдроми Елерса-Данло і Марфана. Класифікація цих синдромів грунтується зазвичай на результатах роботи McKusick, який проаналізував ознаки, симптоми і морфологічні зміни у
  3. Цітомегаповірусная інфекція
    Незважаючи на те, що минуло більше століття після першого опису цитомегалии і третину століття після відкриття цито-мегаловіруса, тільки недавно з'ясувалося широке розповсюдження цієї інфекції та її значення в акушерстві, неонатології, педіатрії, клінічної вірусології, трансфузіології та трансплантології. Відзначається той факт, що цитомегаловірусна інфекція (ЦМВ) є однією з найбільш частих
  4. Рибонуклеїнові кислоти вірусів грипу
    М. В. Лонсі (М. W. PONS) I . ВСТУП Вірус грипу має унікальний в порівнянні з іншими вірусами тварин спектр біологічних властивостей. Він має здатність. До множинної реактивації (Hoyle, Liu, 1951), утворення неповних вірусних частинок (von Magnus, 1954), чутливий до антіноміціну D (Barry et al., 1962), його нуклеїнова кислота неінфекційні-і він має здатність до
  5. Антигенна мінливість вірусу грипу
    Р. Г. Вебстера і У. Г. ЛЕІВЕР i (RG WEBSTER and WG LAYER) I. ВСТУП Вірус грипу типу А1 є унікальним серед 'збудників інфекційних захворювань людини внаслідок своєї здатності настільки сильно змінювати власну антигенну структуру, що специфічний імунітет, набутий у відповідь «а зараження одним штамом, дуже слабо або зовсім не захищає від наступного
  6. ПОРУШЕННЯ ФУНКЦІЇ НИРОК
    Фредерік Л. Ко (Frederik L. Сої) Азотемія, олігурія і анурія Азотемія Для оцінки швидкості клубочкової фільтрації (СКФ) часто вдаються до допомоги вимірювання в сироватці концентрації сечовини і креатиніну . Обидва ці речовини утворюються відповідно в печінці і м'язах з досить постійною швидкістю. Як зазначено в гол. 218, вони повністю фільтруються в клубочках і не реабсорбуються в
  7. Б
    + + + Б список сильнодіючих лікарських засобів; група лікарських засобів, при призначенні, застосуванні і зберіганні яких слід дотримуватися обережності. До списку Б належать ліки, що містять алкалоїди та їх солі, снодійні, анестезуючі, жарознижуючі та серцеві засоби, сульфаніламіди, препарати статевих гормонів, лікарську сировину галенових і новогаленові препарати і
  8. И
    + + + голкотерапія, акупунктура, чжень-цзю-терапія, метод лікування уколами за допомогою голок. Сутність І. полягає в рефлекторному впливі на функції органів з лікувальною метою різними за силою, характером і тривалості уколами. Кожна точка уколу пов'язана каналами (лініями) з певним органом. У тварин таких каналів 14 (рис. 1). Для І. користуються спеціальними голками (рис. 2).
  9. Імунологічні методи діагностики інфекційних захворювань
    Х. Кесарвала, Дж. Кішіяма I. Імунна відповідь при інфекційних захворюваннях. Імунна відповідь - це реакція на чужорідний антиген, яка призводить до накопичення та активації клітин, що у його видаленні. Перебіг і результат будь-якої інфекції залежать від сили імунної відповіді на антигени збудника. А. Механічні бар'єри - шкіра, слизові, миготливий епітелій дихальних шляхів і шлунково-кишкового тракту -
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...