Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
ГоловнаМедицинаОнкологія
« Попередня Наступна »
Петренко А.А. Аналіз метилування ДНК при раку шийки матки, 2003 - перейти до змісту підручника

Блот-гібридизація

Передача ДНК на нейлонову мембрану.

Після закінчення електрофорезу в разі геномної ДНК агарозном гель витримували в денатуруються розчині 1.5 М NaCl - 0.5 M NaOH протягом 30 хв з періодичним погойдуванням. Потім нейтралізували в розчині 0.5 М Tris-HCl pH 8.0 - 1.5 M NaCl протягом 1 години з постійним погойдуванням. У разі продуктів ПЛР попередньої обробки гелю не проводили. Після цього на ДНК-містить область гелю накладали нейлоновий фільтр Hybond N + ("Amersham", UK), змочений в 20 SSC. Зверху поміщали 5-6 см шар фільтрувального паперу і вантаж до 200 р. Перенесення здійснювали в присутності 20 SSC протягом ночі. ДНК фіксували на нейлонової мембрані при 80оС протягом години.

Передача РНК на нітроцелюлозну мембрану.

Після закінчення електрофорезу на РНК-містить область гелю накладали нітроцеллюлозний фільтр Hybond C-extra ("Amersham", UK), змочений в 20 SCC. Зверху поміщали 5-6 см шар фільтрувального паперу і вантаж до 200 р. Перенесення здійснювали в присутності 20 SSC протягом ночі. РНК фіксували на нітроцелюлозній мембрані при 80оС протягом години під вакуумом.

Отримання міченого зонда.

Детекції досліджуваних послідовностей проводили за допомогою гібридизації з радіоактивно-міченим зондом. Для отримання міченого зонда реакційна суміш (12 мкл) містила 12 нг ДНК, 10 пмоль гексапраймера, 1.2 мкл 10 буфера, 0.5 М суміш нуклеотидів dTTP, dCTP і

32

dGTP, 12.5 мкКі a-P-dATP (Обнінськ, Росія), та 3 од. акт. ДНК-полімерази Кленова ("Fermentas", Литва). Суміш ДНК - гексапраймер попередньо витримували у киплячій водяній бані протягом 5 хв, потім швидко охолоджували на льоду і додавали інші компоненти реакційної суміші. Реакцію синтезу проводили протягом 1 годину при 37оС. Очищення

32

радіоактивно-міченого зонда від вільного a-P-dATP проводили на міні-колонці з Sephadex G50 fine, врівноваженою 1 буфером STE з використанням в якості маркера молекулярного ваги Dextran blue. Активність зонда визначали за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника.
Для гібридизації використовували зонд з питомою активністю> 108 імп / (хв> <мкг).

Гібридизація ДНК (РНК), иммобилизованной на мембрані.

Предгібрідізацію мембрани з перенесеною ДНК (РНК) проводили з використанням гібридизаційного буфера при 42 оС протягом 1 год. Гібридизацію проводили у свіжому гібридизаційним буфері, що містить радіоактівномеченний зонд з розрахунку 2 млн. імп. на 1 мл, протягом ночі при 42 оС. Далі мембрану відмивали від непрореагировавшего зонда за допомогою стандартного розчину (2 SSC, 0.1% SDS) 1 раз 10 хв при кімнатній температурі і 3 рази по 20 хв при 60оС. При необхідності

відмивання проводили розчином 1 SSC - 0.5% SDS, а потім розчином 0.1 SSC - 5% SDS. Ступінь відмивання тестували за допомогою лічильника Р-частинок "Експерт", потім фільтр експонували з рентгенівською плівкою в касеті з підсилюють екранами при -70 оС. Тривалість експозиції становила від кількох годин до доби для продуктів ПЛР і від 10 до 30 днів у разі РНК і геномної ДНК.
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
Інформація, релевантна " Блот-гібридизація "
  1. ВРОДЖЕНІ ПОРУШЕННЯ МЕТАБОЛІЗМУ (ОГЛЯД)
    блот-гібридизації ДНК-ДНК для діагностики спадкових метаболічних порушень стало найбільш важливим варіантом застосування технології рекомбінантної ДНК в медицині ( см. гл. 58). Цей підхід грунтується на виділенні ДНК з легко доступних тканин, наприклад лейкоцитів периферичної крові, культивованих фібробластів або клітин амніотичної рідини. Після розщеплення ДНК рестрикційний
  2. Гель-електрофорез
    блот-гібридизації. Електрофорез плазмідної ДНК і продуктів ПЛР проводили при напруженості електричного поля 10-15 В / см протягом 30-45 хв. ДНК в гелі реєстрували по флуоресценції в що проходить ультрафіолеті з довжиною хвиль від 240 нм до 360 нм. Результати протоколювати за допомогою фотографування гелю або системи Gel Imagertm. Электрофоретическоеразделение РНК в агарозному гелі. Поділ
  3. Дослідження експресії і статусу метилювання гена Р3А-адаптіна при раку шийки матки
    блот-гібридизації РНК і ампліфікації кДНК, отриманої зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР). При гібридизації в якості зонда до гену вза-адаптіну ми використовували продукт ПЛР, що включає в себе послідовність перших екзона гена. Амплификацию кДНК проводили з використанням праймерів, розташованих в першому і в другому екзонах гена вза-адаптіна, розділених Інтроном, послідовність якого
  4. Біологічно активні білки вірусу грипу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу
    гібридизації ці автори, крім того, встановили, що очищені ядра зазначених вище клітин in vitro синтезують вірусну і комплементарную їй РНК приблизно в рівних кількостях. Ця ядерна активність полімерази виникає раніше, ніж вона виявляється в цітоплазматіч-ських фракціях. Описані дані показують, що наведені в літературі суперечливі відомості про різні жлассах
  5. Реплікація вірусу грипу
    гібридизацію пульс-меченной РНК в різні моменти після зараження з надлишком або немічених вРНК, або вкРНК з наступною обробкою РНК-азой (Scholtissek, Rott, 1970). У ранніх стадіях інфекційного циклу превалював синтез вкРНК, досягаючи максимуму приблизно «про другого годині після зараження, тоді як у пізніх стадіях велика частина продукується вірус-специфічної РНК була вРНК. Krug
  6. 71. ГЕПАТИТ ХРОНІЧНИЙ
    гібридизації, ПЛР). HBs-Ag (австралійський) з'являється в крові через 1,5 міс після інфікування - Спеціальні методи УЗД, Радіоізотопне дослідження печінки, лапароскопіяЛеченіе - Етіотропне: препарати інтерферону (парентеральні форми природних і / або рекомбінантних а-і В-інтерферонів) - при високому ступені активності інфекційного процесу (наявність маркерів реплікації), а також при позапечінкових
  7. Цитомегаловірусна інфекція
    гібридизації (виявлення вірусної ДНК безпосередньо в досліджуючи-екпортувати зразках). Лікування. Розроблена Н.А. Фарбер схема розрахована на 3-місячний термін лікування: 1-й тиждень - декаріс (левамізол) по 50 мг 2 рази на день після їжі протягом 5 днів, потім 2-денну перерву; 2-я і після-дмуть тижні препарат приймати по зворотній схемі - тільки 2 дні, а протягом 5 днів перерва. Сумарна доза на
© medbib.in.ua - Медична Бібліотека