загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Біологічно активні білки вірусу грипу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу

Р. В. ОІМПСОН і В. Д. БІН (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.)



I. ВСТУП

Ця глава «освячена досить новому розділу в біології вірусу грипу, у зв'язку з чим більша частина інформації фрагментарна по-своєму складу сі включає велике число невирішених питань. Основне твердження, на якому грунтується дана глава, полягає в тому, що мікоовіруси є вірусами з негативним геномом (Barry, Mahy, 1973), тобто вірусами, до складу яких обов'язково входить РНК-полімераза. Цей фермент транскрибирует з матриці фрагментированного генома вірусу молекули комплементарної РНК, які є інформаційними РНК для синтезу вірусних білків. Поділ викладеного матеріалу на дві частини, з одного боку, опис даних про РНК-полімеру-зе інфікованих клітин, а з іншого-про РНК-полімерази очищених вірусних частинок, диктується просто зручністю і не повинно бути витлумачено як підтвердження тієї точки зору, що в цих двох системах функціонують два різних ферменту.

II. АКТИВНІСТЬ РНК-полімерази в інфікованих клітинах

Вперше РНК-залежну активність РНК-полімерази клітин, інфікованих вірусом грипу, виявили Але й Walters (1966) на гомогенізованих хоріон-аллантоісной мембранах курячих ембріонів, заражених (вірусом грипу . Актиноміцин D ь відміну від гуанідінгідрохлоріда інгібі-рова цю активність. Подальші підтвердження цьому-були отримані декількома лабораторіями, увага яких було зосереджено в основному-на різних вимогах до системи, тимчасових аспектах виникнення ферменту і природі одержуваних продуктів (Rage et al., 1968 ; Skehel, Burke, 1968; Ruck et al., 1969; Scholtissek et al., Rott, 1969a). Раніше було зроблено цікаве спостереження того, що інфікування клітин вірусом чуми птахів (FPV) супроводжується чітко вираженим впливом на активність полімерази клітини-хазяїна (Borland, Mahy, 1968). У цій та ряді наступних робіт (Mahy, 1970; Mahy et al., 1972, 1974) вивчали активність полімерази як в ядерцях (полімераза I), так і в іуклеоп-лазме (полімераза II), виявляємо у фракції очищених ядер, ізольованих з інфікованих клітин фібробластів курячих ембріонів. Активність полі-Мераз розрізнялася чутливістю як-до іонного складу середовища, так і ж дії а-аманітіна. Було показано, що. активність, нечутлива до дії-а-аманітіна ( полімераза I), знижується після інфікування вірусом, в той час як чутлива до цього агента полімераза II, яка, мабуть, відповідальна за синтез клітинних інформаційних РНК (Roeder, Rutter, 1970; Zyller, Penman, 1971; Roeder, Roeder, 1972 ), збільшує свою активність до величини, на 70% більшою, ніж активність полімерази в невнфіцірованних клітинах (Mahy et al., 1974). Збільшення активності полімерази II в ізольованих ядрах відповідає першому з двох добре помітних періодів збільшення синтезу РНК в інфікованих-клітинах, спостережуваних за допомогою методу пульсової радіоактивної мітки через .90 хв і 3 год після початку інфекції. Тільки перший з цих двох підйомів активності був чутливий до а-аманітіна, введеному за 1 год до пульсової мітки. Оскільки відомо, що а-аманитин блокує реплікацію вірусу грипу (Rott, Scholtissek, 1970, Mahy et al., 1972), і оскільки дотримуються умови для здійснення активності ДНК (див. гл. VIII), наведені вище дані говорять, ймовірно, на користь гіпотези про те, що один (або. більше) вид мРНК клітини-хазяїна необхідний для реплікації на ранніх етапах репродукції вірусу грипу.

А. АКТИВНІСТЬ ФЕРМЕНТІВ В РІЗНИХ ФРАКЦІЯХ КЛІТИН І ВИМОГИ ДО ТЕСТ-СИСТЕМІ IN VITRO

Результати різних досліджень, присвячених вивченню природи Вірусіндуцірованная активності полімерази в клітинах,-інфікованих вірусом грипу в основному подібні. В-більшості робіт активність полімерази виявляється в мікросомальних фракціях через 1-2 год після початку інфекції (Але, Walters, 1966; Scholtissek, Rott , 1969a; Skehel, Burke, 1969). Крім того, у всіх випадках активність ферменту є РНК-залежною, відбувається на ендогенної матриці (Schwarz, Scholtissek, 1973) і нечутлива до дії екзогенної РНК, дезоксирибонуклеази або акти-номіціна D (табл. Г5).

Вірус-специфічна-активність РНК-полімерази, асоційована з інфікованими клітинами, з достовірністю була виявлена ??в 'Ізольованих клітинних фракціях, що включають мікросомальні елементи ядра, і не виявлялася в клітинному саке, зазвичай представляє собою супернатант гомогената клітин після його ультрацентрифугирования (Scholtissek, Rott, 1969a).

Спільними в реакції полімерази in vitro, 'катализируемой клітинним ферментом, є потреба у всіх чотирьох нуклеозидтрифосфат (Ruck et al., 1969) , температурний оптимум при 28 ° С (Paffenholz, Scholtissek, 1973) і лінійна кінетика реакції протягом принаймні перших 2:00-інкубації. Необхідно відзначити, що, оскільки реакція in vitro підтримується протягом максимального періоду при 28 ° С, інкубація реакційної суміші при більш високих температурах (тобто при умовах, що наближаються до оптимальних умов для 'вірусної реплікації in vivo) призводить до більш високої швидкості синтезу РНК з подальшим різким спадом активності, в період між 30-і 60 хв після' зараження (Paffenholz , Scholtissek, 1973). Зазначений ефект може бути пов'язаний з нестабільністю ферментсубстратного комплексу при вищій, ніж оптимальна, температурі реакції in vitro (цей 'питання буде обговорено далі для вирионной полімерази вірусу грипу).

В літературі все ще є суперечливі точки зору на залежність реакції in vitro, катализируемой ферментом клітини або віріона, від (присутності різних катіонів .. Є повідомлення про 'Необхідності наявності в реакційній середовищі Мп2 + і iMg2 + або одного з цих іонів. Різні висновки в цьому випадку, ймовірно, пояснюються різницею у виборі системи вірус-клітина, використаного методу очищення, а також дійсною концентрацією іонів, присутніх в реакційній суміші. В табл. 16 зведені результати, отримані при вивченні впливу іонів, на роботу лоліме-рази клітини. Нещодавно Horrisberger і співавт . (Horrisberger, Guskey, 1974; Horrisberger, Schulze, 1975) показали, що in vitro активність РНК-полімерази може бути виявлена ??в мітохондріальної супернатальной фракції лізата клітин, інфікованих вірусом грипу штаму A0/NWS при наявності в реакційній суміші або Мп2 +, або Mg2 + . Додавання КС! в реакційне середовище стимулює синтез РНК у присутності Мп2 + і пригнічує його в присутності тільки Mg2 +. Існує декілька пояснень цьому явищу, зокрема твердження про присутність у системі двох ферментів, для роботи яких потрібна присутність різних іонів (Horrisberger, Guskey, 1974 ). Цю точку зору підтверджує також реакція полімерази, у присутності Mg2 +, що має більш високу початкову швидкість і пригнічується через 20 хв, в той час як реакція, яка стимулюється присутністю тільки Мп2 +, підтримується принаймні протягом 2 ч. Абсолютно ясно, що для докази обгрунтованості гіпотези про наявність двох ферментів потрібні подальші дослідження.

Б. З'ЯСУВАННЯ ПРИРОДИ РНК-продуктів, що синтезуються IN VITRO ЗА ДОПОМОГОЮ ФРАКЦІЙ ІНФІКОВАНИХ клітин, що володіють АКТИВНІСТЮ ПОЛІМЕРАЗИ

Як буде більш детально розглянуто далі (див. гл. 8), інфікування пермісивними клітин миксовирусов> ми призводить до синтезу в них вирусспецифических РНК, 'що представляють всі класи розмірів РНК геному очищеного вірусу. РНК віріони типу була виявлена ??в основному у фракції РНП як цитоплазми, так і нуклеоплазми, в той час-як комплементарні до вірусної РНК молекули були знайдені в мінорній фракції РНП цитоплазми (Pons, 1971; Krug, 1972) і, ймовірно, являють собою, принаймні здебільшого, молекули, асоційовані з полісоми (Nayak , 1970; Pons, 1972). Було виявлено невелику кількість двунитчатой ??РНК, також відповідної всім різним за розмірами класам вирионной РНК, але дійсна роль цієї РНК у біосинтезі вірусу ще невідома (Pons, 1967; Pons, Hirst, 1968). На відміну від системи in vivo ідентифікація РНК-продуктів, синтезованих in vitro за участю ферменту клітини, - питання відкрите. З декількох лабораторій (Ruck et al., 1969; Skehel, Burke, 1969; Ma-hy, Bromley, 1969) надійшли повідомлення про синтез молекул

10S я 12S РНК, стійких до дії рібонуклеази в реакційних сумішах, каталізуються мікро-сом альних фракціями інфікованих клітин. Ці молекули, на думку деяких дослідників, являють собою попередників однонитчатим форм (Mahy, Bromley, 1969 ). Набагато менше визначеності мається на встановленні типу одно-нитчастих РНК, синтезованих при цих умовах. На основі порівняльного аналізу продуктів синтезу, проведеного за допомогою використання макросом хоріон-аллантоісной мембран інфікованих курячих ембріонів (штам А/Ле-нінград/62 (H2N2) , Ruck я співавт. (1969) показали, що РНК, синтезовані in vitro, мають нуклеотидний склад, подібний з нуклеотидним складом вирионной РНК. Однак, ло даними Scholtissek (1969), від 85 до 100% продукту, синтезованого в системі in vitro, містить мікросомальні фракції клітин курячого ембріона, 'взятих через 6 год після їх зараження вірусом FPV, могли-бути специфічно гібрддізо-вани з гомологичной вирионной РНК. Використовуючи ту ж систему вірус-клітина на ранніх і пізніх етапах інфекції,' Hastie і Mahy (1973 ) змогли показати, що продукт мікросом-мальной РНК-полімерази, отриманої in vitro, містив від 67 до 93% 1комплементарной РНК залежно від моменту екстракції з клітки. За допомогою відповідного методу гібридизації ці автори, крім того, встановили, що очищені ядра зазначених вище клітин in vitro синтезують вірусну і комплементарную їй РНК приблизно в рівних кількостях. Ця ядерна активність полімерази виникає раніше, ніж вона виявляється в цітоплазматіч-ських фракціях. Описані дані показують, що наведені в літературі суперечливі відомості про різні жлассах однонитчатим РНК, що синтезується in vitro за допомогою ферменту, що виникає в клітці у відповідь на інфікування вірусом грипу, можуть пояснюватися як тим, що клітини відбирали для визначення активності полімерази через різний час після зараження, так і тим, що ця активність вивчалася в різних фракціях клітин.

III. АКТИВНІСТЬ РНК-полімерази, асоційованої з віріони

Повідомлення про наявність у очищених частинок реовірусів РНК-залежної активності РНК-полімерази (Shatkin, Sipe, 1968; Borsa, Graham, 1968) пішло слідом за виявленням вирионной транскреіштази у рабдовирусов (Baltimore et al., 1970), РНК-опухолеродних вірусів (Те-min, Mitzutani, 1970; Baltimore, 1970) і парамиксовирусов (Huang et al., 1971). Перші спроби виявити таку ферментативну активність у вірусу грипу штаму WSN,

вжиті в нашій лабораторії, були невдалими, оскільки тест-система in vitro зажадала спеціального іонного складу середовища. Введення в реакційну суміш Мп2 + дозволило нам виявити-позитивну активність РНК- полімерази у деяких штамів вірусу грипу (Chow, Simpson, 1971). Це спостереження незабаром 'було підтверджено в інших лабораторіях (Penhoet et al., 1971; Ske-hel, 1971). При порівнянні вирионной активності РНК-полімерази вірусу грипу з активністю лолімерази інших вірусів слід зазначити, що транскриптаза вірусу грипу приблизно в 750 разів менш активна, ніж транскриптаза вірусу везикулярного стоматиту та реовірусів відповідно (табл. 17). З іншого боку, вірус грипу штаму A0/WS приблизно в 4 і 20 раз більш активний, ніж вірус хвороби Нькжаетла і вірус Сендай. Реовіруси відрізняються від інших вірусів тварин, що містять вірусну транскриптазу, у відношенні як своєї високої активності РНК-полімерази, так я здатності викликати транскрипцію в системі in vitro (Skehel, Joklik, 1968).

А. ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМИ IN VITRO

Повний склад реакційної суміші, необхідної для спостереження активності РНК-полімерази вяріонов грипу in vitro, в основному схожий з складом, використовуваним при вивченні транекріптази інших оболонкових вірусів тварин .
трусы женские хлопок
Суміш повинна містити вирио в очищеному вигляді, всі чотири луклеозідтріфосфата, відповідний детергент (який, очевидно, необхідний для створення доступності комплексу полімераза-рибонуклеопротеид), моновалентні і дивалентні іони в концентраціях, які ' будуть обговорені далі. Оптимальна температура безперервного полиме-різного синтезу РНК в системі in vitro дорівнює 31-33 ° С (Bishop et al., 1971a) я відрізняється від оптимальної температури для росту вірусу в клітинах (Scholtissek, Rott, 1969b). Цей ефект , ймовірно, пов'язаний з нестабільністю комплексу полімераза-матриця в системі in vitro при підвищених температурах.

Вплив різних катіонів на синтез РНК-продуктів, здійснюваний за допомогою транокрілтази віріонів в системі in vitro, вивчалося декількома групами дослідників . У своїх роботах, присвячених цій ферментативної реакції, Chow і Simpson (1971), Penhoet і співавт. (1971) повідомили, що для здійснення активності транскриптази необхідно присутність в системі Мп2 +. Обидві групи дослідників визначили мінімально необхідну концентрацію цих іонів-1,9 і 4 мМ відповідно. Якщо в реакційній оме-сі Мп2 + замінити на Mg2 +, то синтез РНК проходить на різко зниженому рівні (Chow, Simpson, 1971; Skehel, 1971), хоча наявність іонів Mg2 + в системі і зберігає високу активність ферменту при концентрації Мп2 + нижче оптимальної (Bishop et al., 1971a). У зв'язку з цими спостереженнями можна зробити висновок, що Мп2 + є двовалентним катионом, необхідним для функціонування полімерази віріона грипу в системі in vitro.

  Активність транакріптази частинок вірусу грипу поряд з інгібуванням за допомогою видалення з реакційної системи in vitro необхідних для реакції інгредієнтів гальмується також рібонуклеазою і Поліаніонна (Chow, Simpson, 1971). Інглбіровавіе не спостерігається при введенні в систему актиноміцину D, рифампіцину, а-аманітіна, ДНК-ази (Chow, Simpson, 1971; Penhoet et al., 1971; Skehel, 1971). Однак, як-буде відзначено далі, актиноміцин D, мабуть, пригнічує активність транскрипції, обумовлену ферментами віріона, в інфікованих клітинах на ранніх її етапах (див. табл. 15). Oxford і співавт., Використовуючи вірусну транскріптазная систему in vitro, показали наявність інгібіторного ефекту у селеноцістаміна, похідних фе-на-нтролена і Тіосемікарбазон, а також всіх з'єднань, які є сильними хелатами для «м'яких» важких металів, таких, як цинк (Oxford , 1973a; Oxford, Perrin, 1974). Інгібування активності ферменту, асоційованого з кліткою, за допомогою селеноцістіна було описано раніше (Але et al., 1968; Але, Walters, 1971). На те, що Віріонна транекріптаза може являти собою цінксодержащіх металлоферментов, подібно клітинної РНК-або ДНК-поліме-разі з Е. coli (Scrutton et al., 1971; Slater et al., 1971), вказує присутність цинку в очищених частинках вірусу грипу , що було показано за допомогою методів атомної а "б-сорбції та атомної мас-спектроскошш (Oxford, Perrin, 1975). Важливо, крім того, у цьому зв'язку відзначити, що цинк входить до складу РНК-залежної ДНК-полімерази онкорна-вірусів (Auld et al., 1974). Нещодавно було також виявлено стимулюючий вплив на синтез РНК, що каталізує вирионной полимеразой в системі in vitro, хазяйських факторів клітинного походження (Rochavansky, персональне повідомлення). Один з цих факторів попередньо був ідентифікований як неорганічна пірофосфатази, оскільки цей фермент в очищеному вигляді, так само як екстракти нормальних клітин 'курячого ембріона, стимулював приблизно в 2 рази активність РНК-полімерази вірусу грипу і знімав інгібіторний ефект екзогенного фосфату, який додається в реакційну суміш. Ідентифікація іншого чинника клітини-господаря, який, по- Мабуть, також стимулює транскрипцію в системі in vitro, в даний час проводиться.

  Б. ПРОДУКТИ РЕАКЦІЙ віріони РНК-полімерази

  Реакція, що каталізується вирионами грипу, в ранніх стадіях лінійна і її швидкість пропорційна кількості вірусного білка, використовуваного в тест-системі. При екстракції РНК, синтезованої в цих умовах, за допомогою фенолу з наступною її обробкою сумішшю рнбонуклеаз / \ і Ti було виявлено, що 60-80% продукту лолімеразноп реакції володіють резістентностио до рібоіуклеазе (Bishop et al., 1971). Велику частина що залишився РНКаза-чутливого продукту реакції можна перевести в РІКазо-резнстентную форму за допомогою самогібрідізаціі РНК у сумарній тест-системі. Аналіз цієї РНК за допомогою електрофорезу в полі-

  акріламідном гелі при використанні попередників матриці і лродуктов реакції, мічених за допомогою різних радіоактивних міток, вказує на синтез на ранніх етапах РНК, мігруючих в гелі паралельно с; вирионной матричної РНК, включаючи всі 'Класи розмірів і, крім того, небагато. великих за відносної молекулярної масі фрагментів (Bjshop et al., 1971b). Ці останні продукти реакції можуть бути перетворені (у форми з більшою електрофорезного рухливістю, і з молекулярною масою в межах 5-Ю4-3-Ю5 при нагріванні РНК до 100 ° С. Загальний висновок про РНК, синтезирующейся вирионной транскриптазою вірусу грипу, яке можна зробити на основі описаних експериментів, полягає в тому, що-велика-частина синтезованого in vitro продукту являє собою комплементарную РНК, яка, мабуть, пов'язана з матрицею за допомогою водневих зв'язків з утворенням многонітчатих. комплексів ще неясною природи. Нині немає доказів швидкого витіснення комплементарних низькомолекулярних ланцюгів з цих комплексів під час процесу транскрипції, як це було показано на моделі рабдовирусов, таких, як VSV (Bishop, Roy, 1971).

  Инициаторного послідовність РНК-полімеразної продукту в системі in vitro-була визначена Hefti і співавт. (1975). Вони ізолювали рнбонуклеопротеіновий (Компонент з віріонів грипу штаму WSN і позначили 5'-кінець транс-кріптазного продукту, синтезованого в системі in vitro, що містить-у-мічені нуклеозадтріфосфати. Була знайдена в основному тільки одна инициаторного послідовність - pppGpCp. Незважаючи на висновок авторів про тому, що транскрипція може починатися з цією унікальною послідовності, не "було вирішено питання, чи кожен фрагмент генома вірусу грипу транскрибується в цій системі. Нещодавно McGeoch і Kitron (1975) повідомили, що додавання гуано-зина в полимеразную систему стимулює синтез РНК, комплементарної і вирионной. За умов реакції, ім'я використаних, гуанозин включався в б'-кінець послідовності GpCp. Стимулювання вирионной транскриптази було отримано також за допомогою гуанозин-б'-монофосфату і ді-нуклеотидів GpC і GpG.

  В. віріони АКТИВНІСТЬ транскриптазою В РІЗНИХ штам вірусу грипу

  У першому повідомленні про наявність у складі частинок вірусу грипу РНК-полімерази вказувалося про штаммовие відмінностях активності транскриптази в миксовирусов людини і тварин у системі in vitro (Chow, Simpson, 1971). Подальші дослідження (Bean, 1974) привели до висновку, що на

  спостережуване відмінність в активності транскриптази деяких штамів вірусу грипу сильно впливає відносна чутливість реакції до температури інкубації. На 23 наведена кінетика реакції в системі in vitro вірусу грипу штаму WS і його дочірнього штаму WSN. Ці віруси відрізняються за своїми початковим швидкостям синтезу як при оптимальній, так і при підвищеній (37 ° С) температурі. У вірусу грипу штаму WS початкова швидкість синтезу завжди вище при 37 ° С, а для вірусу грипу штаму WSN спостерігається зворотна залежність. При дослідженні вирионной активності полімерази режомбінантов штамів WS і WSN було показано, що такі ознаки, як гранична швидкість реакції і відношення швидкостей реакції при двох зазначених температурах тест-системи пересортіруются в потомство, що є гібридними частками по інших генетичними маркерами, абсолютно незалежно. Невідомо, чи відображають ці властивості системи in vitro відносну фізичну стабільність транскріптазная комплексу в цілому або ж стабільність його складових частин, зокрема РНК-полімерази. Нещодавно в нашій лабораторії були досліджені на наявність вирионной активності полімерази в системі in vitro умовно-летальні температурі чутливі (ts) мутанти вірусу грипу штаму WSN, які належали до семи різним рекомбінаційно-комплементації-онним групам (Hirst, 1973). Всі ці віруси володіли зниженою активністю ферментів в порівнянні з вірусом дикого типу і лише один з мутантів (WSNts24) мав активність лише «а 5% нижче, ніж у WSN. Ми не змогли знайти кореляції між незвичайної активністю транскриптази таких мутантів і їх специфічним температурочувствітель-ним дефектом (або дефектами). При дослідженні активно-

  ста транскриптази-в вирионах п'яти штамів вірусу FPV - представників різних комллементаціонних груп - в реакційних сумішах при лермісеівних і неперміосівних для зростання (вірусу температурах (36 ° л 42 ° С відповідно) було показано, що один мутант знизив свою ферментативну активність на 71%, в той час / як інші віруси і їх батько дикого типу знизили свою активність при переході до більш високих температур лише на 8-20% (Ghendon et al., 1973). Ні для одного з цих мутантів FPV не було виявлено асоційованої з вірусом лолімерази , яка була б-нефункціональна в «льотках, інкубованих при температурах, що виключають реплікацію вірусу (для порівняння див гол. 7). Однак Scholtissek і співавт. (1974) нещодавно описали ts-мутант FPV, який втрачав здатність викликати значний віруоспеціфіческій синтез РНК в клітинах, інкубованих при нелерміосівной температурі, незважаючи на те що мікросомальна РНК-полімеразна активність виявлялася в екстрактах цих клітин в реакційних сумішах в системі in vitro при температурі 40 ° С, коли синтез вірусу не мав місця. Автори не змогли пояснити причину спостережуваного в цьому разі невідповідності між функціональною активністю РНК-'Полімерази вірусу грипу в двох описаних системах.

  Доказ відмінностей в РНК-залежної РНК-лоліме-разі гетерологичних серотипів вірусу грипу приведено в роботі Scholtissek і співавт. (1971). Було показано, що кон-валесцентлая сивороша курчат, інфікованих FPV, ін-гібіровала активність мікросомальної РНК-полімерази, виділеної з клітин, заражених або гомологічними, або гетер про логічними мікровірусів А, але не володіла такою властивістю при інфікуванні клітин вірусом Тріппа В або параміксовірусом NDV. Ці дані були розглянуті як додатковий аргумент на користь того, що РНК-полімераза вірусу грипу принаймні частково кодується вірусним геномом. У зв'язку з тим що раніше дослідження транскриптази вірусу грипу проводилися в основному на штамах A, Oxford (1973) нещодавно провів дослідження двох штамів вірусу грипу В. Ці дослідження показали, що віруси даного типу також можуть відрізнятися за активності РНК-полімерази в системі in vitro .

  Г. АКТИВНІСТЬ РНК-ПОЛІМЕРАЗИ В СИСТЕМІ IN VITRO НЕПОВНОГО ВІРУСУ І вірусний КОМПОНЕНТІВ

  Виконані раніше в інших лабораторіях дослідження продемонстрували, що неповні або дефектні частинки вірусу грипу (фон-магнусовскій тип), продукують в результаті декількох пасажів при високій множинності

  зараження в підходящої хазяйської системі, містять неповний набір вирионной РНК і володіють зниженою інфек-ціонностио (von Magnus, 1954; Ada, Perry, 1956; Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1969). Нещодавно ми лровелі дослідження активності РНК-полімерази препаратів фон-магнусовского вірусу грипу (Bean, 1974; Bean, Simpson, 1975), враховуючи, що неповні Т-частинки деяких рабдовирусов, як було показано раніше, втрачали свою транакріптазную актівнсгть (Roy, Bishop, 1972; Reichman et al., 1974). Ми виявили, що неповні частки вірусу грипу А (штамів WS або WSN), які володіли в 10 000 разів нижчою інфек-ціонностио, ніж нормальні частинки, і які володіли дефіцитом, як було встановлено раніше Pons і Hirst (1969) і Duesberg ( 1968), високомолекулярних фрагментів вирионной РНК, знизили свою транскріптазная активність в системі in vitro принаймні в 2 рази.
 Оскільки раніше було показано, що всі класи вірусного нуклеопротеида мають добре виражену активність РНК-лолімерази (Bishop et al., 1972), можна очікувати, що неповні частки вірусу грипу будуть проте мати каталітичної активністю в транскрілтазной реакції в системі in vitro, незважаючи на свою неповноцінність. У зв'язку з цим цікаво відзначити, що можна лолучіть дефектні частинки вірусу грипу, які, очевидно, мають нормальним набором фрагментів РНК, але мають знижену в 20 разів інфвкціонность (Pons, Hirst, 1969). У нашій лабораторії було показано, що ні максимальне зниження найбільшого за розмірами фрагмента вирионной РНК (приблизно на 2/3), ні деяке зниження активності лолімерази в вирионе, ймовірно, не є причиною набагато більшого за величиною зменшення інфекційності популяції неповного вірусу. Всі разом ці факти вказують на те, що знижена інфекційність цих вірусних частинок пояснюється іншими, неясними в даний час, причинами.

  Д. ІДЕНТИФІКАЦІЯ ВІРУСНОГО поліпептиді, відповідальних за АКТИВНІСТЬ транскриптазою

  В даний час залишилися нез'ясованими два питання, пов'язаних з ідентифікацією структурного поліпелтіда (або поліпептидів), відповідального за активність транскриптази віріона, вірусу грипу та механізм взаємодії цього поліпептиду з ферментом, асоційованим з клітиною. У складі білків фракції рібояуклеопротеіда диссоційованих вірусних частинок штаму WS, що володіє активністю транскриптази, знаходиться в основному білок NP (відносна молекулярна маса «^ 55000) і сліди високомолекулярного поліпептиду Р (відносна молекулярна маса сі 90000) (Bishop et al., 1972) . Недавні дослідження рибо-

  нуклеопротелда, отриманого з штаму WSN, підтвердили ці результати і, крім того, показали, що компоненти Pi і Р2 високомолекулярних білків входять до складу фракції, що володіє активністю транскриптази (Rochovansky, персональне повідомлення). Було виявлено, що як з очищених частинок вірусу грипу, так і з мікросомальної фракції інфікованих вірусом. Клітин можуть бути ізольовані компоненти нуклеокапсида, що мають активність полімерази і ідентичні як-морфологічно, так і за плавучої щільності. Цей факт є сильним аргументом на користь того, що описані асоційовані з кліткою структури фізично еквівалентні транскрибується комплексу, виявляє в ннтактних вирионах (Compans, Caliguiri, 1973). Хоча спочатку було повідомлено, що компоненти вірусного нуклеокапеіда, що володіють активністю транскриптази і виділені з інфікованих вірусом грипу клітин, містять тільки білок NP (Compans, Caliguiri, 1973), ті ж дослідники пізніше виявили в аналогічних фракціях поліпептид Р. Автори використовували відповідну техніку радіоактивної мітки , необхідну для виявлення цього білка, який, ймовірно, синтезується на дуже ранніх етапах інфекційного циклу (Caliguiri, Compans, 1974). До цих пір всі спроби відокремити мік-росомальную лолімеразу від внутрішньої матриці і отримати фермент, функціонування якого пов'язано з додаванням екзогенної РНК, були невдалими (Schwarz, Scholtissek, 1973). Негативний результат проведених до теперішнього часу спроб ізолювати ферментативно-активну по-лімеразу може бути пов'язаний з необоротним руйнуванням самого вірусного ферменту або з абсолютною необхідністю присутності интактного рибонуклеопротеидов як функціональної матриці. Подібним чином методи,. Які з успіхом використовували для знищення та 'відновлення активності транскриптази віріона, асоційованої з нуклеопротеїд рабдовирусов (Bishop et al., 1974), не дали результату при вивченні очищених вірусів грипу (Bishop, персональне повідомлення). У кінцевому рахунку ідентифікації віріояной і клітинної РНК-лолімерази та з'ясуванню того, наскільки для їх роботи необхідно присутність матриці, має передувати успішне здійснення подальших спроб виділити ці ферменти у функціонально-активному вигляді.

  Е. КІНЕТИЧНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ТРАНСКРИПЦІЇ ВІРУСУ ГРИПУ В ІНФІКОВАНИХ КЛІТИНАХ

  Як неінфекційний характер генома вірусу грипу, так і присутність у складі мікоовірусов вирионной РНК-лолімерази знаходять своє відображення в тому, що первинним подію-

  тием, що відбувається в клітинах, інфікованих вірусом грипу, є транскрипція вірусної матричної РНК в комплементарную форму (Baltimore, 1971). У нашій лабораторії вивчалися ці процеси, що мають місце в інфікованих клітинах, для того щоб визначити, наскільки транскрипція вирионной РНК 'в системі in vivo з точки зору кінетики реакції і чутливості її до дії різних інгібіторів подібна з її транскрипцією в системі in vitro.

  Як повідомили нещодавно Bean і Simpson (1973), можна простежити перетворення меченной по 32Р 'вирионной матричної РНК в стійкі до дії рібонуклеази комплекси, які утворюються в результаті її гібридизації з знову синтезуються нитками комплементарної РНК, присутньої в гібрідізаціонних сумішах тотальної РНК, виділеної через різне час. після інфікування клітин радіоактивно міченим вірусом грипу. Цей метод ефективний при спостереженні за синтезом комплементарної РНК в клітинах до тих пір, поки через деякий час після початку інфекції не будуть синтезовані такі кількості віріонів РНК, що вона почне конкурувати в гібридизації-ційної суміші з введеної в систему міченої РНК-На 24 представлена ??кінетика синтезу комплементарної РНК 'в системі in vivo, проаналізована за допомогою цього методу. Принциповою особливістю транскрипції в оістеме in vivo, закономірності якій відображені на малюнку, є її двофазний характер. Концентрація продукту транскрипції, який виявляється в системі через 40-60 хв після початку інфекції, лінійно збільшується до позначки приблизно 90 хв, потім відбувається дуже швидкий її ріст. Дія на транскрипцію in vivo таких сполук, як актиноміцин D і циклогексимид, цікаво в світлі нх різної дії і інгібування синтезу комплементарної та вірусної РНК відповідно (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Актиноміцин D, доданий в систему в момент початку інфекції, повністю інгібує транскрипцію in vivo, в той час як циклогексимид не впливає на первісну (первинну) транскрипцію, але інгібує її вторинний підйом (див. 24). Якщо транскрипцію in vivo простежити протягом більш тривалого часу, як це показало на 25, то можна помітити, що кількість стійких до дії рібонуклеази РНК знижується після 3 год інкубації.

  Це явище ми пов'язали з виникненням в 'клітці конкуруючих молекул віріонів РНК (Bean, Simpson, 1973). Якщо, проте, циклогексимид додавали до клітин після початку посиленою транскрипції, то такого зниження не відбувалося, ймовірно, за рахунок селективного блокування цим

  з'єднанням синтезу віріони РНК (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). Навпаки, додавання в систему антіноміцінаD через 2 год після початку інфекції. Призводить до різкого спаду змісту стійкою до дії РНК-ази РНК, що виникає після гібридизації сумарною клітинної РНК. Природним поясненням цього ефекту є те, що актиноміцин D переважно інгібує синтез комплементарної РНК «не діє на освіту додаткової вирионной РНК, яка конкурує з міченої матричної РНК під час гібридизації. Це пояснення 'було раніше запропоновано іншими дослідниками (Scholtissek, Rott, 1970; Pons, 1973). У нашій лабораторії недавно були проведені дослідження, присвячені дії інших інгібіторів «а процес транскрипції in vivo. Зокрема, було виявлено, що транскрипція вірусу грипу в системі in vivo інгібіруетея попередньою обробкою клітин курячих ембріонів 'кордіеешгаом, а-аманітіна, мітоміцином С, інтерфероном і ультрафіолетовим випромінюванням (Bean, Simpson, 1973; Bean, 1974). Очевидна необхідність присутності

  ендогенної функціональної хазяйської ДНК для ініціації процесу транскрипції віршонов грипу в перміосівних клітинах знаходить відображення в залежному від дози придушенні транскрипції in vivo в клітинах, опромінених до початку інфекції ультрафіолетовою радіацією.

  IV. ВИСНОВОК

  Дослідження, описані в цьому розділі, можуть служити стимулом для продовження роботи з вивчення РНК-залежних PiHK-полімераз миксовирусов та з'ясуванню їх ролі в інфекційному процесі. Питання про те, чи грають фрагменти. Комплементарної РНК, синтезовані цим ферментом, безпосередню роль у синтезі вірусних білків, до цих пір не вирішено (Seigert et al., 1973; Kingsbury, Webster, 1973) н потребує подальших досліджень. Крім того, в даний час ще не проведена хімічна ідентифікація транскриптази вірусу грипу, і повинні 'бути зроблені

  героїчні зусилля для ізоляції цього ферменту в активному вигляді, щоб привести його повну характеристику. Ймовірно, самий заплутане питання, який чекає свого рішення, - це питання про роль клітини-господаря в ініціації та здійсненні синтезу вир іонних РНК-Хоча актиноміцин D і не робить помітного дії на активність вир іона і полиме-раз клітини в системі in vitro, це з'єднання, так само як ультрафіолетове опромінення> і інші інгібітори активності клітинних ДНК, блокує транскрипцію-в системі in vivo. Ці факти, а також неможливість виявити віріони продукти в інфікованих 'без'ядерних клітинах (Follet et al., 1974; Kelley et al., 1974), вказують на те, що для транскрипції вірусу грипу необхідно функціонуюче ядро. Однак наявність в системі in vivo первинної транскрипції в присутності циклогексаміду є додатковим аргументом на користь того, що для протікання транскрипції непотрібен наявності трансляції 'знову синтезованих мРНК. В даний час не висунуто небудь підходящої гіпотези, яка задовольняла б усім цим заплутаним даними. Разом з більшістю дослідників, які вивчають ці цікаві проблеми, ми сподіваємося, що можна буде більш ясно зрозуміти, яким чином транскрипція вірусу грипу регулюється клітинними і вірусними факторами. Ці значення можуть сильно допомогти нам у розробці ефективних хіміотераяевтіческіх підходів для контролю за МВК-совірусной інфекцією людини і тварин.



  ЛІТЕРАТУРА

  Aaslested H. G., Clark H. F., Bishop D. H. L., Koprowski H. J. Virol .. 1971

  Ada G. L., Perry В. Т. J. gen. Microbiol., 1956, v. 14, p. 623. Auld D. S., Kawaguchi D. M., Livingston D. M., Vallee B. L. Proc. nat. Acad.

  Sci. U. S., 1974, v. 71, p. 2091.

  Baltimore D. Nature (London), 1970, v. 226, p. 1209. Baltimore D., Bacteriol. Rev., 1971, v. 35, p. 235. Baltimore D., Huang A. S., Stampfer M. Proc. nat. Acad. Sci. U. S., 1970,

  v. 66, p. 572. Barry R. D., Mahy B. W. J., eds. Negative Strand Viruses, New York, Acad.

  Press, 2975. Bean W. J., Jr. Doctoral Dissertation, Rutgers, The State University of New

  Jersey, New Brunswick, 1974.

  Bean W. J., Jr., Simpson R. W. Virology, 1973, v. 56, p. 646. Bean W. J., Jr., Simpson R. W. J. virol. Submit, publ., 1975. Bishop D. H. L., Roy P. J. mol. Biol., 1971, v. 57, p. 513. Bishop D. H. L., Obijeski J. F., Simpson R. W. J. Virol., 1971a, v. 8, p. 66. Bishop D. H. L., Obijeski J. F., Simpson R. W. J. Virol, 1971b, v. 8, p. 74. Bishop D. H. L., Roy P., Bean W. J., Jr., Simpson R. W. J. Virol., 1972

  Bishop D. H. L, Emerson S. JJ., Flamand A. J. Virol., 1974, v. 14, p. 139. Borland R., Mahy B. W. J. J. Virol, 1968, v. 2, p. 33. Borsa /., Graham A. F. Biochem. biophys. Res. Commun., 1968 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Біологічно активні білки вірусу грипу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу"
  1.  ПРИНЦИПИ ВІРУСОЛОГІЇ
      Кеннет Л. Тайлер, Бернард Н. Філдс (Kenneth L. Tyier, Bernard N. Fields) Структура і класифікація вірусів. Типова вірусна частка (вирион) містить ядро, що складається з нуклеїнової кислоти - ДНК або РНК. Існує значна варіабельність структур і розмірів вірусних нуклеїнових кислот (табл. 128-1). Геноми з мінімальною мовляв. масою, як, наприклад, у парвовирусов, налічують 3-4
  2. В
      + + + Вагіна штучна (лат. vagina - піхва), прилад для отримання сперми від виробників сільськогосподарських тварин. Метод застосування В. і. заснований на використанні подразників статевого члена, замінюють природні подразники піхви самки, для нормального прояви рефлексу еякуляції. Такими подразниками в В. і. служать певна температура (40-42 {{?}} C) її стінок,
  3.  Кільбурн Е.Д.. Віруси грипу та грип (1978), 1978
      Книга присвячена огляду різноманітних вірусів грипу, їх культивування, біохімії і особливостям молекулярного пристрою. Зміст: Віруси грипу та грип. Структура вірусу грипу. Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін. Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу. РНК вірусів
  4.  Віруси грипу та грип
      Е. Д. Кільбурн (Е. D. KILBOURNE) I. ВСТУП. ГРИП - ЗАХВОРЮВАННЯ З Незмінних симптоматики, викликає Змінюється ВІРУСОМ Величезний інтерес, який притягається до сучасної вірусології до грипу і вірусів, відповідальним за його виникнення, вимагає пояснення, якщо врахувати ординарний характер симптоматики цього, зазвичай дуже помірного, інфекційного захворювання дихальних шляхів
  5. О
      + + + Обволікаючі засоби, см. Слизові кошти. + + + Знешкодження м'яса, см. Умовно придатне м'ясо. + + + Знезараження води, звільнення води від мікроорганізмів, патогенних для тварин і людини. Методи О. в.: Хлорування, кип'ятіння, озонування, знезараження ультрафіолетовими променями, ультразвуком, струмами високої частоти і ін Найчастіше застосовують хлорування води, використовуючи
  6.  Структура вірусу грипу
      П. В. ШОППІН І Р. В. КОМПАНС (PW CHOPPIN, Я. W. COMPANS) I. ВСТУП Вивчення вірусу грипу протягом тривалого часу перебувало «а передовому рубежі структурних досліджень у вірусології. Вірус грипу одним з перших був вивчений: допомогою електронної мікроскопії (Taylor et al., 1943), і при використанні саме цього об'єкта в якості моделі було "вчинено, що деякі віруси
  7.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін
      І. Т. ШУЛЬЦ (I. Т. SCHULZE) I. ВСТУП ТОЙ факт, що віруси грипу мають здатність агглютинировать еритроцити, відіграв велику роль у розвитку наших уявлень про ці інфекційних частинках. Гемаглютинація виявилася вкрай зручним методом для ідентифікації, очищення і визначення. Концентрації вірусів. Крім того, з (моменту виявлення явища гемагглю-тінаціп 35 років тому
  8.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу
      Д. Букера і П. ПАЛЕЙЗІ (BUCHER, P. PALESE) I. ВСТУП Існування нейрамінідази вперше припустив в що стала нині вже класичній роботі Hirst (1942). Він виявив, що якщо агглютінірованних у присутності'іруса грипу еритроцити деагглютініровать, то при додаванні до них 'нового вірусу вони знову не здатні до аглютинації. При цьому, однак, елюіровать вірус не
  9.  Реплікація вірусу грипу
      К. ШОЛТІССЕК і Х.-Д. Кленк (пор. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. ВСТУП З проблеми реплікації вірусу грипу існує ряд оглядів. Література до 1968 р. узагальнена в статтях Hoyle (1968) 'і Scholtissek (1969); пізнішими роботами є огляди White (1973), а також Compans і Choppin (1974). Більшість даних по реплікації отримано при 'вивченні вірусу грипу типу А. Істотних
  10.  . Білки вірусів
      3.1.Амінокіслотний склад вірусних білків Білок всіх досліджених до теперішнього часу вірусів побудований із звичайних амінокислот, які належать до природного L-ряду. D-амінокислот у складі вірусних частинок не знайдено. Співвідношення амінокислот у вірусних білках досить близько до такого в білках тварин, бактерій і рослин. Вірусні білки не містять зазвичай великої кількості
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...