загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу

Д. Букера і П. ПАЛЕЙЗІ (BUCHER, P. PALESE)



I. ВСТУП

Існування нейрамінідази вперше припустив в що стала нині вже класичній роботі Hirst (1942). Він виявив, що якщо агглютінірованних у присутності'іруса грипу еритроцити деагглютініровать, то при додаванні до них 'нового вірусу вони знову не здатні до аглютинації. При цьому, однак, елюіровать вірус не втрачає своєї здатності агглютинировать свіжі еритроцити. Невідома субстанція зраджувала властивості поверхні червоних кров'яних тілець. Прозорливе припущення Hirst про те, що на поверхні віріона повинен функціонувати якийсь фермент, не відповідало поширеною в той час точці зору, згідно з якою віруси відрізняються від бактерій в основному тим, що в їх складі ферменти повністю відсутні.

Приблизно до середини 60-х років яе було відомо, функціонує-ли нейрамінідаза окремо від гемаглютиніну і чи є вона самостійним білком. Hirst (1942) припустив, що явище гемаглютинації відображає зв'язування ферменту з субстратом і обидва явища - аглютинація і еля-ція - можуть 'бути пояснені існуванням одного ферменту. Hirst (1942) вказав на схожість розглянутої реакції з реакцією фермент - субстрат. Передбачалося, що освіта проміжного продукту 'взаємодії ферменту з субстратом, так' називаю фермент-субстратного комплексу, еквівалентно реакції гемаглютинації. Після хімічної модифікації субстрату фермент-субстратної комплекс розпадається, і фермент відновлює здатність адсорбуватися на нових молекулах субстрату і міняти їх хімічну структуру. Hirst припустив, що поняттю «субстрат» у реакції гемаглютинації відповідає якусь речовину на шоверхності рецепторів еритроцитів і що воно руйнується в результаті реакції гемаглютинації.

Пізніше Burnet (1951) підтвердив, що ферментативні і ге-матглютінірующіе центри 'віріона ідентичні.

Після відділення нейраміяідази від гемаглютиніну, спочатку за допомогою протеолітичного ферменту трипсину (Мау-ron et al., 1961; Noll et al., 1962), а потім за допомогою детергентів, таких, як SDS ( Laver, 1963), стало ясно, що ці два компоненти віріона є індивідуальними білками. Однак абсолютний доказ цього твердження було дано після того, як стало можливим відокремити індивідуальні в антигенному сенсі нейрамінідазу і гемагглю-Тинина в дослідах ло генетичної рекомбінації і довести їх біохімічне та антигенну відмінність (Laver, Kilbourne, 1966). Ada і Lind (1961) припустили, що нейрамінідаза може бути ферментом клітини-господаря, включеним в ві-Ріон,. Оскільки неінфіковані «льотки курячих ембріонів володіли нейрамінідазной активністю, а аятісиворот-, ка до нейрамінідазі вірусу, вирощеного in ovo, інгібуючої-вала яейрамінідазную активність клітин курячого ембріона. Однак більш-пізні роботи показали, що хоча вірусний фермент антигенно подібний з ферментом системи, де вірус репродукувати (in ovo або в клітинах нирок теляти), 'кросе-реажціі між клітинної нейрамінідазою і нейрамінідазою вірусу, ймовірно, визначаються наявністю у цих ферментів загальних детермінантів вуглеводної природи (Ada et al., 1963).

II. СПЕЦИФІЧНІСТЬ нейрамінідази

Gottschalk (1957), Blix і співавт. (1957) встановили, що фермент, що входить до складу віріонів грипу, гидролизует гликозидную зв'язок, що з'єднує кетогруппу N-ацетілнейр-аминовой кислоти (NANA) з И-галактозою, D-галактоза-ном або, можливо, з іншими цукрами. За ферментом затвердилася назва «нейрамінідаза» - NA (Gottschalk, 1957). Крім того, для позначення ферменту часто вживається термін «сіалідаза». Ці назви є відображенням того, що фермент відщеплює речовину, яку називають або нейрамінової, або сиаловой кислотою (Heimer, Meyer, 1956). Номенклатурне назву нейрамінідази, згідно з «Класифікації ферментів» (1965),-мукополісаха-рид И-ацетілнейрамінілгідролаза, ЄС 3.2.1.18. Фермент гидролизует зв'язок між термінальній сиаловой кислотою і з'єднаної з нею за допомогою а-зв'язку молекулою цукру. Огляди робіт з вивчення властивостей бактеріальних і вірусних нейраминидаз були опубліковані Drzeniek (1972, 1973), а також Gottschalk і Drzeniek (1972).

У природних нейрамінової. Кислотах аминогруппа при вуглецевому атомі Cs завжди заміщена на N-ацетил-або на

N-гліколільную групу, а гідраксільная група (групи) іноді Про -ацетильованого (Blix et al., 1957; Gottschalk, 1960). О-ацетильную групи заміщають тідроксіли в положенні 4, 7 або 8 і легко відщеплюються після обробки розведеними лугами або кислотами. У більшості тварин N-ацетил-і N-гліколілнейраміновие кислоти існують в один і той же час, причому відношення їх змісту різному для різних видів тварин і для різних тканин і секреторних виділень у випадку одного виду (Gottschalk,. I960). Специфічність нейрамінідази залежить від виду заступника при атомі азоту в сиаловой кислоті субстрату; N-ацетільная форма розщеплюється нейрамінідазою вірусу грипу з набагато більшою швидкістю, ніж N-гліколілнейр-Аміновен кислота (Flockton, Hobson, 1970). Було показано,, ярмо нейрамінідаза вірусу грипу є високоспецифічним ферментом і що її специфічність відрізняється від специфічності бактеріальних нейраминидаз (Drzeniek, 1972). Використовуючи синтетичні похідні нейрамінової кислот, Meindl і тіррени (1966а) показали, що для того, щоб гід-ролізовать субстрат за допомогою нейрамінідази, абсолютно необхідна присутність вільної карбоксильної групи. Заміщення N-ацетильной групи більш об'ємними групами, такими, як бензоільная, бутильну або бензілоксікарбо-нільная, перетворює нейрамінсодержащій субстрат в стійке з'єднання для гідролізу бактеріальними нейро-нідазамі (Meindl, Tuppy, 1966; Faillard et al., 1969). Чутливість субстратів до гідролізу вірусними нейраміні-дазамі значно знижується після окисного відщеплення від молекули нейрамінової. Кислоти вуглецевого атома Се або атомів Cs і Сд. Це вказує на високу структурну специфічність дії нейрамінідази (Suttajit, Winz-ler, 1971).

Природа зв'язку нейрамінової кислоти з вуглеводної частиною (аглікогон) також важлива для специфічності дії нейрамінідази. Грунтуючись на результатах, отриманих з використанням природних субстратів, у більшості яких нейрамінової кислота пов'язана з агліконом а-евязью, був зроблений висновок, що нейрамінідаза розщеплює тільки а-зв'язку (Gottschalk, 1957, 1958; Kuhn, Brossmer, 1958). Використовуючи синтетичні субстрати, Meindl і Tuppy (1966a, b) показали, що фермент НЕ отщепляет нейрамінової кислоти, приєднані до аглікону (З-связью. Будова атлвкояа, мабуть, не грає істотної ролі (Schauer, Faillard, 1968).

Вуглецевий атом С2 нейрамінової кислоти може бути з'єднаний з вуглецевими атомами С3, С6 і, можливо, С4 галактози, вуглецевим атомом С6 N-ацетілгалактозамін, вуглецевим атомом С6 ацетил ^-глюкозаміну або з Cg інший

молекули нейрамінової кислоти (Drzeniek, 1973). нейро-нова. кислота завжди знаходиться на кінці ланцюга, якщо вона не приєднана до іншої молекулі нейрамінової кислоти зв'язком (а, 2 - * 8) (Gottschalk, Drzeniek, 1972) . Бактеріальні нейрамінідази діють переважно на а-кето-зідние зв'язку, такі, як (а, 2 - * 3), (а, 2 -> ~ 4),, а, 2 - ІБ) і (а, 2 - > -8), а вірусні нейрамінідази, такі, наприклад, як нейрамінідаза вірусу хвороби Ньюкасла і вірусу чуми птахів (FPV), в основному гидролизуют зв'язку 2-Ьз (Drzeniek, 1967, 1972, 1973). Обидві ці вірусні нейрамінідази щодо неактивні щодо зв'язків 2-Іг і 2-йз (Drzeniek, 1967; Huang, Orlich, 1972), а зв'язок 2 -> -8 розщеплює нейрамінідаза FPV (Drzeniek, Gauhe, 1970).

III. СУБСТРАТИ ДЛЯ нейрамінідази

А. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ N-ацетілнейраміновой КИСЛОТИ

Метод, який зазвичай використовують при визначенні концентрації нейрамінової. Кислоти, включає освіту пофарбованого з'єднання при додаванні тіобарбітурової кислоти. Він був розроблений Warren (1959, 1963) і модифікований Aminoff (1959, 1961). Метод дозволяє вимірювати концентрацію вільної «ейраміновой кислоти в присутності пов'язаної ацетілнейраміновой кислоти. Якщо вихід забарвленого продукту при визначенні концентрації N-ацетил-нейро-Мінова кислоти прийняти за 100%, то його вихід при проведенні реакції з похідними нейрамінової кислоти становитиме: для N-гл'Іколілнейраміновой кислоти - 63%, М-ацетил-4- 0-а | цетілнейрам | ІНОВА кислоти-100%, N-ацетил-8-О-ацетілнейрам'ІНовой кислоти - 47% і N-ацетил-7-О-ацетілнейраміновой кислоти - 0% (Drzeniek, 1972).

Б. ПРИРОДНІ СУБСТРАТИ

Нейрамінідазу унікальна по своїй здатності взаємодіяти з субстратами самих різних розмірів (Ci-nader, 1967)-від сіаліллактози з відносною молекулярною масою (ОММ) 633 до овомукоід (ОММ 44000) та від фетуіна (ОММ 48400) до чгдікопротеіда, виділеного з сечі (ОММ 7-Ю6).

Все субстрати можна розбити иа дві групи - високомолекулярні і низькомолекулярні. Низькомолекулярні природні субстрати охарактеризовані повніше і, ймовірно, обмежуються лише одним прикладом: N-ацетілнейрамінілла'ктозой

або сіаліллактозой (17). N-ацетілнейрамініллактозу вперше ізолювали з молозива великої рогатої худоби (Kuhn, Brossmer, 1958). Вона містила близько 8-14% а, 2 -> ~ 6) зв'язків і близько 72% зв'язків типу (а, 2 -> -3) (Sehneir, Rafelson, 1966; Ohman, Hygstedt, 1968). Молекули зі зв'язком типу (л, 2-бавовна) можуть бути відокремлені від молекул зі зв'язком (а, 2 -> -3) за допомогою іонообмінної хроматографії за методом, описаним Sehneir і Ralelson (1966). В ідеальному випадку в якості субстрату для нейрамінідази вірусу грипу повинна бути використана N-ацетілнейрамініллактоза типу (а, 2 -> -3), проте зазвичай для цієї мети використовують суміш ізомерів двох типів. Як субстрат для нейрамінідази, «ромі того, використовують низькомолекулярні синтетичні сполуки, властивості яких будуть описані далі.

У природі існує багато високомолекулярних сполук, що містять сіалові кислоти. При визначенні придатності субстрату для проведення кількісного визначення нейрамінідази вірусу грипу необхідно знати гомогенність і чистоту субстрату. Має значення тип СІА-ловой кислоти (наприклад, N-ацетил-, N-глікозил-або ON-діацетілнейраміновая кислота), що міститься в субстраті. Придатність речовини для роботи з вірусними нейраміні-дазамі визначається також тим, який вид зв'язку: '(а, 2 -> -3), (а, 2 -> -8) або (а, 2 - * 8) існує між нейрамінової кислотою і агліконом. Раніше в якості субстратів використовували велику кількість глікопротеїдів, що містять опалову кислоту, але тільки деякі з них були охарактеризовані з біохімічної точки зору.

Фетуін, аг-гликопротеид ембріональної сироватки теляти, є найбільш поширеним субстратом, вперше використаним в тестах на вірусну нейрамінідазу. Spiro (1960) виділив фетуін з ембріональної сироватки теляти з виходом 17% від загального вмісту білків сироватки. Сіалова кислота становить 8,7% загальної маси поліпептиду, відносна молекулярна маса якого

дорівнює 48400. Сіалова кислота знаходиться в основному в N-ацетильной формі з вмістом N-гліколілнейраміно-вої кислоти 7% від загальної кількості сиаловой. Кислоти. Умови для визначення іейрамінідази з використанням фе-Туіна як субстрат були стандартизовані для об-наоуженія нейрамінідазной антитіл (Aymard-Henry et al., 1973).

В якості нейрамінідазной субстрату часто використовують також муцини з підщелепних залоз. Зміст N-гли-коліл-або N-ацетілнейраміновой. Кислоти (варіює залежно від джерела виділення муцину (Gottschalk et al., 1972). Наприклад, муцин, виділений з підщелепної залози вівці, містить в основному N-ацетілнейраміновой-кислоту, в склад муцину, виділеного з підщелепної залози свині, входить переважно N-гліколілнейраміновая кислота, а до складу бичачого муцина входить як N-глнколіл, так і N-ацетілнейраміновой. кислота. Оскільки нейро-нідаза вірусу грипу розщеплює N-ацетильную форму нейро-аминовой кислоти з більшою ефективністю, ніж N-Глік-лільную форму (див. розділ II), кращим субстратом можна вважати муцин, виділений з підщелепних залоз вівці. мукоїди ластівок (роду Collocalia), виділений з їстівних пташиних гнізд, запропонували як субстрату для нейрамінідази Howe і співавт. (1961). нейрамінової кислота становить приблизно 9-13% маси мукоїди. Однак велика кількість ацетогрупп нейрамінової кислоти присутній в ньому не в N-ацетильной, а в О-ацетильной формі (Ка-than, Weeks, 1969). В Як субстрат для нейрамінідази вірусу грипу використовували також орозомукоід-сі-кислий гликопротеид сироватки людини (Rafelson et al., 1963a).

При порівнянні швидкостей відщеплення N-ацетілнейраміновой кислоти від деяких (високомолекулярних субстратів Rafelson і співавт . (1963а) визначили, що якщо прийняти кількість NANA, відщеплюється від сіаліллактози, за 100%, то від мукоїди Collocalia отщепах 26%, від гаптоглобина 1-1-23%, від гаптоглобина 2-2 - 22%, від орозомукоида - 17 %, від інгібітора, ізольованого з стром еритроцитів, - 10%, від гликопротеида сечі - 5% N-ацетілнейраміновой кислоти. Однак, хоча і є велика різниця в швидкостях відщеплення, абсолютна кількість отщепляют за достатній час від зазначених субстратів нейрамінової кислоти змінювалося в межах 58-85%, якщо за 100% прийняти відщеплення від сіаліллактози.

Зовсім мало відомо про реальні субстратах, підданих дії нейрамінідази під час реплікації вірусу грипу in vivo. Відомо, що нейрямінідаза отщепляет нейрамінової кислоту від поверхневого рецептора еритроцитів при елюції з них віріонів грипу. Цей рецелторний

  білок - глікопротеїдів з відносною молекулярною масою близько 31000 - був виділений в чистому вигляді і володів М-і N-групоспецифічною активністю крові (Kathan, Winzler,. 1963; Winzler, 1972). Аналогічні глікопротеїди інших клітинних мембран були вивчені так само докладно.

  В. СИНТЕТИЧНІ СУБСТРАТИ

  Велике 'кількість синтетичних субстратів для нейрамінідази було отримано за допомогою приєднання ароматичних і аліфатичних спиртів до С2 вуглецевого атома різних похідних нейрамінової. Кислоти (Tuppy, Gottschalk, 1972). ЦІ синтетичні субстрати можна приготувати з високим ступенем чистоти. Вони можуть допомогти в розумінні механізму специфічності різних нейраминидаз. Meindl і Tuppy (1967) запропонували використовувати в якості зручного кристалічного субстрату для нейрамінідази фенілкетозід N-ацетілнейраміновой кислоти: 2-феніл-^ ацетілнейраміновой кислоту. Відщеплюється в цьому випадку фенол визначали за допомогою фенольной реакції Фолина. І. М. Привалова і А. Я-Хорлін (1969) описали синтез 2-р-нітрофеніл-^ ацетілнейраміновой кислоти, яку також можна використовувати в якості зручного субстрату для нейрамінідази. Подібний субстрат - 2 - (О /-метоксифеніл)-г \ 1-ацетілнейраміновой кислота (МФН) (Tuppy, Palese, 1969) можна успішно застосовувати як субстрат з використанням фенольной реакції Фолина (Palese et al., 1973). Іншу методику використання МФН як субстрат описали Sedmak і Grossberg (1973). Після ферментативного відщеплення МФН відщепленні 3-метоксіфенол (МФ) визначають як солюбілізірованних комплекс діазоніевой солі з МФ. Білок у високій концентрації заважає визначенню * вільного фенолу за методом Фолина (Palese et al., 1973), але не грає ролі в МФ-діазоніевой методі (Sedmak, Gross-berg, 1973), що дозволяє проводити визначення нейро-нідазной активності тотальних вірусних препаратів. МФН також використовували для виявлення нейрамінідазной активності в поліакриламідних гелях і целлюлозоацетатних пластинах (Tuppy, Palese, 1969; Bucher, Kjlbourne, 1972), а також для фарбування бляшок вірусів, що містять нейро-нідазу (Palese et al., 1970, 1973). Для виявлення вірусу за допомогою методу бляшок в моношар клітин вводять вірус грипу або парагрипу, і на моношар наносять шар агару. Після необхідної інкубації додають субстрат і діазо-Нієв сіль 4-аміно-2 ,5-діметоксінітразобензола, які дифундують крізь агар. У місцях реплікації вірусу субстрат гідролізується і утворює з діазоніевой сіллю нерозчинний продукт червоного кольору (18). З цих фокусів може бути ізольований інфекційний вірус.

  Нещодавно був синтезований флюоресцирующий субстрат для нейрамінідази - 4-1метілілум'белліферріл-Г \ [-ацетил-нейрамінової кислота (Palese, неопубліковані дані). Субстрат дозволяє-швидко і з високою чутливістю визначити нейрамінідазной активність. Розробка такого роду субстратів повинна полегшити дослідження з вивчення властивостей нейрамінідази, а також допомогти в розробці методів її виділення та кількісного визначення. Конфігурація цих субстратів може допомогти в подальших дослідженнях природи активного центру ферменту.

  IV. ХІМІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ нейрамінідази

  А. КОНСТАНТА Міхаеліс

  Константа Міхаеліса (Км) відображає ступінь спорідненості ферменту до субстрату і є параметром, який можна використовувати для порівняння нейраминидаз, виділених з різних штамів. Величини Км для різних штамів вірусу грипу при використанні як субстрату М-ацетілсіалілла.ктози (а, 2 -> ~ 3) рівні: PR8 (N1) Км==1,0-Ю-3 М, оптимум рН 7,0; А2 (Японія) / 305/57 (N2) Км==2,0-Ю-4 М, оптимум рН 6,5; FPV Км=4,0-10 ^ 4 М, оптимум рН 6,0; B / Lee Км=2,0-10 ~ 4 М, оптимум рН 6,8; дані підсумовані в роботі Gottschalk і Drzeniek (1972). Як величина Км, так і оптимальне значення рН є субстрат-залежними величинами.

  Використовуючи синтетичний субстрат МФН при рН 5,8, Sed-mak і Grossberg (1973) знайшли, що величина Км для нейрамінідази штаму A0/NWS/39 (N1) дорівнює 3,5 | 10-3 М, а для нейрамінідази, виділеної з A2 / R 15 + / 57, Х7 і X7 (F1) (N2), ця величина дорівнює 6,5-6,9 - 10 ~ 4 М, що вказує на п'ятикратне відмінність в спорідненості до субстрату цих двох типів нейраминидаз. Як для сіаліллактози, так і для МФН нейрамінідаза типу N2 має в 5 разів більшу спорідненість до субстрату, ніж нейрамінідаза типу N1. Однак абсолютна спорідненість Км обох типів нейраминидаз до сіаллактозе в 3 рази'ише, ніж до МФН.

  Б. Оптимум рН

  Оптимальне для роботи нейрамінідази вірусу грипу значення рН залежить від штаму вірусу і використовуваного субстрату. На відміну від кислих значень рН, оптимальних для нейраминидаз бактерій і ссавців, аналогічні значення для нейрамінідази вірусу грипу зазвичай зрушені в лужну сторону і ближчі до нейтральних значень рН. Kendal і Madeley (1969), використовуючи як субстрат сіаліллактозу, іашлі, що для (великого числа штамів вірусу грдоша, включаючи штами вірусів грипу АТ, A1 (N1), A2 (N2), В, а також вірусу А пташиного походження, оптимум рН лежить в межах 6,4-7,0. Оптимальне значення рН залежить також від виду зв'язку, розщеплюваного ферментом. Schneir і Rafelson (1966) визначили, що нейрамінідаза (N2) розщеплює хімічну зв'язок (а, 2 -> -3) з максимальною швидкістю гару рН 6,5, в той час як та ж нейрамінідаза для розщеплення зв'язку (а, 2 -> -6) має оптимальне значення рН 4,5. Проте максимальна швидкість розщеплення (а, 2 -> -6) N- ацетілсіаліллактози становила, тільки 6% від аналогічної швидкості для (а, 2 -> -3) форми субстрату.

  В. інгібіруванн ПРОДУКТОМ РЕАКЦІЇ

  Нейрамінідазу вірусу грипу 'конкурентно інгібується. продуктом нейрамінідазной реакції - N-ацетілнейраміно-вої кислотою, хоча для цього потрібні відносно високі концентрації нейрамінової кислоти. Walop і співавт. (1960), використовуючи як субстрат сіаліллактозу, визначили Ки=5,0-10-3 М для нейрамінідази штаму A2/57/Sing (N2). Rafelson і співавт. (1963b) для штаму PR8 (N1) визначили Ки=2-10 ^ 2 М і Ки=4-10-3 М для азіатського штаму при опти-мумах рН 7,0 і 6,5 відповідно. Це означає, що спорідненість нейрамінідази N2 до продукту реакції в 5 разів вище, ніж аналогічна величина для нейрамінідази N1. Таке ж співвідношення існує між спорідненістю Км нейрамінідази N2 н Ki до субстрату ферментативної реакції.

  Г. термостабільність і ПОТРЕБА В іонах КАЛЬЦІЮ

  Хоча ці дві властивості на перший погляд здаються абсолютно незалежними, з'являється все більше фактів, що вказують на їх зв'язок. Burnet і Stone (1947) показали, що нейрамінідаза Vibrio cholerae має температуру інактивації на 8 ° С вище в (Присутності іонів 2 + Са, чехМ в їх відсутність. Схожий ефект був продемонстрований для нейрамінідази вірусу грипу штаму B / Lee. Boschman і Jacobs ( 1965) виявили, що нейрамінідаза штамів FMl (Nl), А2 Японія (N2) і B / Joh різко підвищують свою температурну чутливість після обробки ЕДТА. Було, "крім того, показано, що термостабільність і потреба в іонах. кальцію міняються від штаму до штаму (Boschman, Jacobs, 1965; Dimmock, 1971). Нейрамінідазу штаму АТ (WSN) (N1) повністю втрачає свою активність після прогрівання в відсутність Са2 + (Dimmock, 1971). Якщо ж у розчині були Са2 +, то 35% активності зберігалося. Іони магнію не можуть замінити Са2 + для отримання ефекту стабілізації. Дія Са2 + може бути зворотним в присутності ЕДТА.

  Необхідність Са2 + для роботи нейрамінідази, поза її зв'язки з фактором термостабильности, була предметом дискусії протягом декількох років. Хоча підвищення активності було в наявності, важко 'було показати абсолютну необхідність для роботи ферменту присутності саме Са2 +. Wilson і Rafelson (1967), видаляючи іони кальцію за допомогою гель-фільтрації на колонці з сефадексом або за допомогою додавання ЕДТА для повного зв'язування їх слідів, показали зниження на 20% активності нейрамінідази N2; максимальну активність можна отримати, додавши 0,1 мМ Са2 + . Майже абсолютна необхідність присутності іонів кальцію була показана Dimmock (1971) для нейрамінідази WSN (Nl). У відсутність Са2 + ак ~ чвность нейрамінідази становила близько 1% вихідної активності, для отримання максимальної активності було потрібно 3 мМ Са2 +. Нейрамінідазу типу N2 (Японія) вимагала для своєї максимальної активності 0,3 мМ 2 + Са. Та'к чином, мається десятикратне відмінність

  в потреби в іонах 'кальцію для нейрамінідази типу N1 і нейрамінідази типу N2. Особливі труднощі виникають при вивченні дії малих (концентрацій іонів кальцію (особливо у випадку нейрамінідази N2) у зв'язку з тим, що 'більшість субстратів містять двовалентні іони в кількостях, достатніх для забезпечення потреби вірусної нейрамінідази (N2) в іонах кальцію (Wilson, Rafelson, 1967).

  У декількох роботах з вивчення термостабільності було показано, що NA типу N1 щодо термолабільного, a NA типу N2 термостабильна. Rafelson і співавт. (1963а) показали, що нейрамінідаза PR8 (N1) повністю інактивує-ється при нагріванні до 55 ° С протягом 30 хв, в той час як нейрамінідаза азіатського штаму (N2) зберігає 67% своєї активності при аналогічній обробці. Paniker (1968) виявив, що термостабільність нейрамінідази вірусу грипу змінюється в широких межах. Штами A2 (N2) мають найбільш термостабільним ферментом, на активність якого не впливає нагрівання протягом 1 год при 45 ° С, а нейрамінідазу штамів NWS і WSE (Nl) найбільш термолабільного.

  V. ЗМІСТ нейрамінідази В оболонки вірусу

  Як було визначено, для таких штамів вірусу грипу, як А0/Ве1/42, який містить нейрамінідазу типу N1 (Skehel, Schild, 1971), як рекомбінант Х7, до складу якого входить нейрамінідаза типу N2 (Laver, Kilbourne, 1966) і вірусу грипу В, штам B / Lee (Laver, 1963), вміст нейрамінідази становить близько 7% від сумарного вмісту білків в вирионе. Незважаючи на збіг величин, отриманих у цих роботах, було виявлено, що кількість нейрамінідази, що включається в вірусну частку, може бути недостатнім і залежить від типу клітин, на яких вирощують вірус, і від штаму вірусу. Laver (1963) виявив, що кількість NA * залежить від типу клітин-господарів і становить 6% від загального вірусного білка при вирощуванні вірусу in ovo і 14%, якщо вірус вирощується на клітинах нирки теляти. Laver і Kilbourne (1966) виявили, що в рекомбннантном штамі X7 (F1) (H0N2) міститься в 2 рази більше «ейрамінідази, ніж у штамі X7 (H0N2) при вирощуванні вірусів in ovo. Palese і Schulman (1974) виявили десятикратне відмінність у змісті нейрамінідази у двох антигенно ідентичних лабораторних рекомбі-Нант вірусу грипу (H0N2), вирощених in ovo. Mow-showitz і Kilbourne (1975) спостерігали подібні відмінності в нейрамінідазной активності ізольованих вірусів двох

  штамів Aichi (H3N2) дикого типу. Використовуючи метод підрахунку частинок, Seto (1964) виявив, що неповний вірус штамів PR8 (H0N1) і Японія/305 (H2N2) володіє нейро-амінідазной активністю, в 2-4 рази меншою, ніж стандартний вірус.

  Якщо вважати, що зміст NA * становить 7% сумарного (білка віріона (а білок становить 70% маси всієї вірусної частки) (Frommhagen et al., 1959), і прийняти за масу однієї вірусної частки величини W=4-10 ~ 16 ( Reimer et al., 1966), то число молекул NA * на один вирион можна визначити з наступного рівняння (Skehel, Schild, 1971). Передбачається, що NA * являє собою тетрамер з відносною молекулярною масою 24 000 (Wrigley et al., 1973 ), а N - число Авогадро:

  ^% NA=49 молекул NA па вирион

  Kendal і співавт. (1968) визначили абсолютний зміст білка на один вирион, рівне 4-Ю-16 г, і, грунтуючись на змісті NA * в 10% від сумарного білка віріона і на її молекулярній масі в 220 000, розрахували, що в вирионе грипу штаму А / Сінгапур/1/57 (H2N2) міститься 100 молекул NA * на одну вірусну частку. Оскільки, згідно з розрахунками Tiffany і Blough (1970), на поверхні вірусної частки міститься 550-600 «шипів», можна вважати, що 50-100 з них представляють собою NA *, а інші 500 - 'НА *.

  А. Солюбілізація нейрамінідази

  Для вивчення властивостей NA * (як ферментативних, так і антигенних) зручно мати 'фермент, відокремлений від інших компонентів вірусної оболонки. Оскільки NA * локалізована в вірусної оболонці, саме це зумовлює способи її солюбилизации і відділення від віріона та інших вірусних компонентів. Методи солюбилизации NA * можна розділити на дві групи: а) солюбілізація за допомогою протеолітіче-екіх ферментів і б) солюбілізація за допомогою поверхнево-активних речовин. Особливості виділення NA * за допомогою обох методів наведено в табл. 13.

  Солюбілізація. NA *, мабуть, не змінює її ферментативних властивостей. Активна в біологічному і антигенному відношенні NA * була виділена протеолізом або за допомогою поверхнево-активних речовин іонної і неіонної природи (Drzeniek et al., 1966). Після виділення NA * мала ту ж, що і до виділення, величину Км, оптимум рН і Са2 +-зави-симость (Drzeniek et al,, 1966). Виділену з віріона після обробки детергентами або протеолітичними ферментами iNA * нейтралізували антисироваткою в тій же мірі, що і NA * интактного віріона (Ea'sterday et al., 1969). Одна-

  ко Webster і Laver (1967) виявили, що виділена за допомогою детергента-NA * типу N2 володіє «дефіцитом» анти-генності в порівнянні з антигенностью NA * того ж типу in situ.

  Було показано, що iNA * вірусу грипу штаму B / Lee є найбільш стабільною і може-бути виділена практично з 100% виходом після обробки віріонів SDS або трипсином (Laver, 1963). NA * вірусу B / Lee, крім того, нечутлива до дезоксихолат натрію (Laver, 1963). Що. Стосується вірусу грипу типу А, то найбільш просто за допомогою обробки SDS або протеолітичними ферментами виділяється-NA * зі штамів А2 (N2). Ця NA *, крім того, щодо температурно-етабільна. Використання нейтральних детергентів дозволило виділити NA * типу N2 (Webster, Darlington, 1969), а також iNA * типу N1, виділення якої в чистому вигляді особливо важко (Gregoriades, 1972). Hoyle і Almeyda (1971) показали, що NA *, виділена з штамів вірусу грипу типу А2 (N2) і B / Lee, майже повністю стійка до дії пронази і трипсину; NA *, виділена з штамів PR8 (N1) і свинячого (N1 ), лише частково стійка, a NA * вірусу грипу типу А1 (N1) і штаму A / DSP (
  Для солюбилизации NA * такі методи, як руйнування ультразвуком, ефіром або денатуруються агентами (сечовина або гуанідінгідрохлорід), застосовні в малому ступені, ймовірно, у зв'язку, з високими агрегаційна властивостями цього ферменту. Руйнування віріонів за допомогою ефіру, мабуть, вивільняє НА * і NA * у вигляді сополімер-ного агрегату (Hoyle, 1952; Davenport et al., 1960; Schafer). Цей вид руйнування вірусних частинок в основному використовували до того, як Laver ізолював NA * (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Paucker et al., 1959; Hoyle et al., 1961).

  Кращим є такий, вид ізоляції NA *, який не вимагає руйнування ковалентних зв'язків. Використання детергентів для солюбілізації iNA * дозволяє виділити і інші вірусні білки, які у хімічному відношенні не відрізняються від відповідних вірусних компонентів, хоча і можуть втрачати свою біологічну активність (Bucher, 1975). Мабуть, при протеолітичної солюбилизации NA * втрачає деяку частину своєї молекули, необхідну для утримання ферменту на вірусної оболонці і не бере участь у ферментативному акті. Lazdins і співавт. (1972) показали, що на відміну від ізоляції NA * за допомогою детергента (SDS) або лротеолітічеоком (трипсин) виділення з штаму B / Lee кожна субодиниця ферменту втрачає

  відрізок-молекули в 7000; за даними Wrigley і співавт. (1973), при тих же умовах кожна субодиниця NA * B / Lee втрачає ділянку в 12 000.

  Основна відмінність, що спостерігається при лротеолітіческом і детергентні виділення NA *, полягає в тому, що при солюбі-лізації за допомогою протеолітічеокіх ферментів вона втрачає здатність до агрегації. При (протеолітічеоком виділенні має місце «дійсна» солюбілізація, в той час як iNA *, отримана за допомогою детергентів, агрегує при видаленні солюбілізірующего агента (Lazdins et al., 1972). Кожен етап очищення NA * після її солюбілізацін за допомогою детергента повинен виконуватися в його присутності для того, щоб, по-перше, мати справу з ферментом в дисоційованому стані, а Ео-друге, для запобігання втрати його активності. Laver і Valentine (1969), а також Rott і співавт. (1970) показали наявність агрегатів в препаратах iNA * типу N2 при видаленні детергенту. За даними Grego-riades (1972), при видаленні детергенту NA * штаму WSiN (N1) агрегує і втрачає свою активність. Webster (1970b) виявив високу агрегаційну здатність для NA *, виділеної з віріонів за допомогою детергента, навіть у присутності 6 М гуанідінгідрохлоріда в умовах відновлення.

  1. Використання протеолітичних ферментів

  Протеолітичні ферменти різної специфічності або суміш протеолітичних ферментів (таких, як пролазу) можуть використовуватися для солюбілізації NA * в активній формі. Це свідчить, по-перше, що активний центр NA * у високому ступені стійкий до протеолізу і, по-друге, що відрив гідрофобного «хвоста» може бути здійснений практично будь-яким протеолітвческім ферментом. Для відщеплення необхідно наявність декількох ключових амінокислот; чи відбудеться гідроліз в тому чи іншому місці - не має великого значення. Протеолітичні ферменти зазвичай покористуються у високих концентраціях (1-2 мг / мл і вище), які можна порівняти с. Концентрацією вірусних (білків при малому часі інкубації. Оскільки NA * вірусу перебуває в «нативном» стані, вона, мабуть, більш стійка до протеолізу, ніж після денатурації ферменту. Вуглеводні залишки NA * можуть грати роль «захисників» ферменту від атаки протеолітічеокімі ферментами, а також «направляти» протеолітичні ферменти до специфічних областям, в яких повинен відбутися розрив ланцюга. Що стосується ферментів, використовуваних для солюбілпзаціі NA *, то слід зазначити, що трипсин, володіючи найвищою з усіх

  відомих ендопептідаз ступенем специфічності місця розриву, розщеплює | біло, до в області карбоксильного кінця залишків лізину і аргініну (Walsh, 1970). Хімотрипсин розщеплює білок переважно по ароматичним амінокислотам поліпептидного ланцюга (Wilcox, 1970). Пептідаза На-Гарсія (або субтілізін BPN ') є серинових протеазой, що розщеплює велике число пептидних та ефірних зв'язків (Ottesen, Svendsen, 1970). Проназа являє собою суміш декількох протеолітичних ферментів, включаючи ендопеп-тідазу і екзопептідази,. Віднайдені штамом Streptomy-ces griseus Kl (Narahachi, 1970).

  2. Використання детергентів

  Детергенти, використовувані для ізоляції вірусних
  Успішне виділення NA * в активному стані за допомогою електрофорезу в целлюлозоацетатних пластинах (Laver, 1963, 1964) у присутності SDS залежить від того, чи маємо ми справу з SDS-чутливим НА * і SDS-нечутливою NA *, Після руйнування вірусних частинок за допомогою SDS NA *, мігруюча під дією ендооомотіческого потоку, рухається до катода і відокремлюється від НА *. Для штамів типу А2 НА * і NA * мігрують спільно (до катода), і для виділення NA * потрібно провести генетичну рекомбінацію з більш ранніми варіантами вірусу грипу для того, щоб отримати НА *, інактівіруемой в присутності SDS (мігруючий до анода). NA штаму NWS (N1) денатурує в присутності SDS.

  Б. ОЧИЩЕННЯ НЕЙРЛМІНІДАЗИ

  Слідом за Солюбілізація NA * з препаратів очищеного вірусу її можна виділити за використанням комбінації се-діментаціонних, хроматографічних і (або) електрофор-тичні методів. Оскільки активний фермент має константу седиментації 8-10S, а інші вірусні компоненти можуть мати нижчі або 'більше' високі швидкості седиментації, зазвичай першим етапом очищення є ультрацентрифугирование, що виконується частіше з використанням градієнта або сахарози, або глютамат натрію. Останній метод зручний тим, що при його використанні можна прямо виміряти активність NA * за допомогою тіобарбітурової кислоти без небажаного впливу сахарози (Biddle, 1968). За допомогою щодо низької центрифугування зазвичай відокремлюють NA * від вірусних частинок, а при другому центрифугировании з більш високою швидкістю або з більш крутим сахарозний градієнтом відокремлюють повільно седімен-тірующіе вірусні білки від NA *, яка седіментірует з більшою швидкістю.

  Наступні етапи очищення зазвичай включають хромато-графічні методи розділення макромолекул або за розмірами, 1как у разі гель-фільтрації з використанням се-фадекса G-200 або біогелю Bio-Red A5 (Kendal et al., 1968; Bucher, Kilbourne, 1972), або методи розділення з використанням іонообмінних смол, таких, як DEAE-целюлоза, на якій NA * типу iNl досить ефективно адсорбується при нейтральних значеннях рН (Gregoriades, 1972). Laver (1963, 1964) використовував метод електрофорезу на целюліт-зоацетатних пластинах у присутності SDS. У зв'язку з тим що метод електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності SDS дозволяє проводити розділення 'макромолекул за розмірами (Weber, Osborne, 1969), цей вид електрофорезу був використаний для виділення NA * вірусу грипу (Bucher, Kilbourne, 1972). Для ізоляції з суміші білків солюбілі-зірованним за допомогою детергентів NA * використовували і метод електрофокусіровкі (Gregoriades, 1972). Очистити NA * завдяки її ферментативної активності можна методом афинной хроматографії при використанні колонки з низькомолекулярним інгібітором нейрамінідазной активності - Np-амінофенілоксамовой кислотою (Cuatrecasas, II-liano, 1971; Bucher, 1973, 1975). Якщо врахувати, що NA * вірусу грипу являє собою гликопротеид, її можна виділити, використовуючи Афінам хроматографію з використанням ЛЕКТА-нів (Hayman et al., 1973).



  В. ВИЗНАЧЕННЯ СТУПЕНЯ ОЧИЩЕННЯ

  Після ізоляції NA * з віріонів можна використовувати кілька ^ критеріїв її чистоти. Один з них - збільшення питомої активності в стандартних умовах. Якщо прийняти, що NA * становить 7% всіх білків віріона, то максимальне збільшення питомої активності препарату може становити 14-15 разів. Однак цей критерій дуже важко використовувати на практиці, оскільки, з одного боку, має місце збільшення активності. NA * при виході її з віріона, а з іншого - на її активність одночасно впливає велика кількість денатуруючих факторів залежно від умов солюбілізації і типу використовуваного штаму вірусу. У зв'язку з цим дуже важко судити про ступінь очищення NA *, грунтуючись на її питомої активності.

  Як критерій чистоти препарату NA * використовували відсутність адсорбції його на еритроцитах, проте, незважаючи на наявність цієї властивості, препарат все ж може зберігати здатність до індукції антитіл до НА * (Wilson, Rafelson, 1963; Drzeniek, Rott, 1963). Таким образам, додатковим критерієм ступеня чистоти виділеної NA * може бути те, що при її використанні як иммуногена не продукує антитіла до інших компонентів віріона.

  Оскільки в даний час: добре відомо положення смуги NA * при електрофорезі в поліакриламідному гелі, одним з критеріїв її чистоти може бути присутність однієї смуги висойомолекулярногб гликопротеида при проведенні електрофорезу в невідновлювальних умовах. Після відновлень ця смуга повинна перетворитися, в одну або дві смуги, положення яких відповідає відносній молекулярній масі приблизно 60000 при повній відсутності інших смуг. У цьому випадку на поліакрил-амідний гель слід нанести 5-10 мкг білка

  VI. ВЛАСТИВОСТІ ІЗОЛЬОВАНОЇ нейрамінідази А. СКЛАД АМІНОКИСЛОТ

  У зв'язку з тим що NA *, отримана при дії на Вирна-ни SDS, після видалення детергенту агрегує «хвостами», ймовірно, за рахунок їх гідрофобних властивостей (див. 20; Laver, Valentine, 1969), і оскільки відомо, що ці частини молекули NA * отщепляются при лротеолізе (Lazdins et al., 1972; Wrigley et al., 1973), цікаво порівняти загальне число полярних і неполярних залишків для NA * типу N2 (X7/F1), отриманої за допомогою детергентного (Laver, Baker , 1972) і лро-теолитическими (Kendal, Eckert, 1972) методів. Природно, що більш надійно було б провести таке порівняння, використовуючи дані, отримані однією групою дослідників, однак, на жаль, таких результатів в даний час ще немає. Якщо вважати, що полярними амінокислотними залишками є лізин, гістидин, аргінін, асларагіно-вая кислота, треонін, серії та глутамінова. Кислота, то серед 535 амінокислотних залишків (див. раніше) є 280 полярних для NA *, виділеної за допомогою детергентного методу, і 264 полярних залишку для ферменту, ізольованого за допомогою протеолізу, тобто в останньому випадку спостерігається дефіцит 6% полярних залишків. Якщо як неполярних залишків розглядати пролин, валін, метіонін, ізолейцин, лейцин, тирозин, фенілаланін і сумарний цистеїн, можна бачити, що в NA *, ізольованою за допомогою детергента, міститься 186 неполярних залишків, a NA *, отримана при дії протеолітичної ферменту , включає 171 неполярний залишок, тобто в процесі обробки ферментом втрачається 8% неполярних амінокислотних залишків. Таким чином, амінокислоти в області, яка втрачається при лро-теолізе молекули NA *, не є в значній мірі більш гідрофобними, ніж амінокислоти, що входять до складу активної частини молекули. Ймовірно, конформація шоліпеп-тидной ланцюга набагато-більш важлива для створення гідрофобного характеру цієї області, ніж тип амінокислот, що входять до її складу.

  Число залишків лізину і аргініну становить інтерес у зв'язку з вивченням пептидних карт гідролізатів нейрамінідази, отриманих за допомогою трипсину. Kendal і Eckert (1972) визначили, що в кожній субодиниці міститься 50,1 залишку лізину і аргініну, Layer і Baker дають величину 57,0 залишків. Дані за загальним числом цистеїнових залишків цих авторів також істотно; відрізняються. Kendal і Eckert (1972) визначили 21 залишок: цистеїну,. Laver і Baker (1972) - 14. Ці дослідники знайшли також різне число метіонінових залишків :: для одного і того: ж типу нейрамінідази Kendal і Eckert (1972) наводять величину 9,3, a Laver і Baker (1972) -5,9. Зміст залишків метіоніл-на в нейрамінідазі важливо для дослідження структури цього ферменту, з, допомогою його розщеплення ціанідом'брома,

  яке відбувається. по залишках метіоніну. Грунтуючись на роботі Kendal і Eckert (1972), можна припустити, що в результаті такого розщеплення утворюється 9-10 фрагментів, а на підставі роботи Laver і Baker (1972) таких фрагментів повинно спостерігатися 6 або 7. Для вирішення цієї суперечності потрібні додаткові дослідження з визначення складу амінокислот.

  Дуже мало відомо про вуглеводної частини нейраминидаз-| ного глікопротеїду. За Kendal і Eckert (1972), в молекулі ферменту міститься 5,7 залишку глюкозаміну. Lazdins і співавт. (1972) повідомили про втрату при виділенні нейрамініда-зи за допомогою протеолітичних ферментів в області макромолекули з високим вмістом глюкозаміну.

  Б. АМІНОКИСЛОТИ АКТИВНОГО ЦЕНТРУ

  Деякі дослідники намагалися визначити природу амінокислотних залишків, що входять в активний центр NA *, проте отримані результати були неоднозначні. Hoyle (1969) привів докази присутності залишків тирозину і гіетідіна в активному центрі і не зробив 'яких певних висновків про залишки цистеїну, метіоніну, триптофану, аргініну і лізину. З іншого боку, Bachmayer (1972), провівши дослідження за N-бромсукцінімідной модифікацією, з великою впевненістю вказує на наявність в активному центрі триптофану. Ізольована за допомогою пронази NA * вірусу грипу типу А2 (N2) повністю втрачала свою активність після обробки N-бромсукцинімід. Субстрати NA *, такі, як сіаліллактоза або фетуін, оберігають фермент від подібного роду інактивації.

  В. ізоелектрична ТОЧКА

  Ізоалектріческая точка була визначена для NA *, отриманої як протеолітичним (Neurath et al., 1970; Kendal et al., 1973), так і детергентним (Neurath et al., 1970; Grego-riades, 1972) методами. Neurath і співавт. (1970), Kendal і співавт. (1973) виявили великі відмінності в ізоелектрі-чеських точках NA * типу N2 залежно від того, протеолітичним або детергентним методом був отриманий фермент. Gregoriades (1972) очищала NA * типу N1 (WSN) за допомогою неіонних детергентів і отримала гомогенний препарат з ізоелектрічеокой точкою pi 6,0. Kendal я співавт. (1973) виявили при ізоелектричному фокусуванні NA * типу N2 принаймні 6 піків в межах pi від 5,2 до 6,5 з основними піками в області 5,5-5,8. В обох випадках ізоелектрична точка була злегка зрушена в кислу область. Денатурована NA * (Kendal et al., 1973) мала ізоелектрична точку на 1,5-2,0 одиниць рН нижче, ніж нативний фермент, що вказує на можливе конформационное маскування в нативної молекулі NA * великої кількості бічних карбоксильних груп. Для NA *, виділених із штамів A2/Aichi/68 і B/Mass/66, Neurath і співавт. (1970) виявили піки pi в межах рН від 5 до 9. Це вказує на те, що ізоелектрична точка у вірусної NA * ближче до нейтральних значень рН, ніж у NA * Clostridium perfringens (pi 4,95) або Vibrio cholerae (pi 4,80), які мають фіксовані значення ізоелектричної точок. Neurath і співавт. (1970) не використали детергент в дослідах по електрофокусірованію, хоча сама NA * була отримана з віріонів за допомогою детергента і у зв'язку з цим можливим поясненням гетерогенності ізоелектричної точки може бути ефект агрегації. Gregoriades (1972) отримала фіксовану ізоелектрична точку при рН 6,0 для NA *, ізольованою за допомогою детергента у присутності в середовищі неіонних детергентів. Можна очікувати, що препарат NA *, виділений за допомогою обробки протеолітичними ферментами, гетерогенний за рахунок можливої ??множинності місць розривів поліпептидного ланцюга. Однак Kendal і співавт. (1973) виявили гетерогенність NA * навіть після того, як відокремили індивідуальний пік після ізоелектрофокусіровкі і знову завдали його на фокусуючу колонку.

  VII. СТРУКТУРА нейрамінідази

  Абсолютно точно встановлено, що NA * існує на поверхні віріона вірусу грипу у вигляді палочкообразной виступів. В даний час, однак, ще ніхто не досяг такого дозволу електронного мікровідколи, яке дозволило б виявити відмінність між «шпильками» на вірусної поверхні і однозначно ідентифікувати, які з «шпильок» є NA *, а які НА *. Laver і Valentine (1969) не змогли ідентифікувати «шипи» NA * у зв'язку з великою близькістю цих поверхневих структур один до одного. Як Kendal і Madeley (1970), так і Compans і співавт. (1969) вказують на виявлення на поверхні віріонів після їх інкубації спільно з антисироваткою до NA * областей, де концентруються антитіла. Отже, NA * може бути зосереджена в локальних ділянках поверхні віріона. Ці спостереження, крім того, підтвердили той факт, що NA * не локалізована тільки в підстави шипів, оскільки антитіла прикріплялися до іх'внешнім кінців.

  Незалежно від того, протеолітічеакім або детергентним методом ізолюється NA * з віріонів вірусу грипу, вона седіментірует в області 8 - 10S і має відносну молекулярну масу 200000-250 000. . Крім того, NA *, ізольована з допомогою протеолітичних ферментів, має трохи більш низьку швидкість седиментації і меншу молекулярну масу, ніж NA *, отримана з віріонів за допомогою детергентів. Noll і співавт. (1962) розрахували, що NA * типу B / Lee, отримана за допомогою сояюбілізаціі трипсином, має відносну молекулярну масу 190 000. Ці розрахунки грунтувалися на константі седиментації в 9S і парціальному питомій обсязі (V), рівному 0,7 ом / м. Kendal і співавт. (1968) провели аналогічні розрахунки для NA * типу N2, ізольованою с. Допомогою протеази Нагарсе, і отримали молекулярну масу 220 000, приймаючи константу седиментації рівної 8S, a V=0,733 см / м. За даними Wrigley і співавт. (1973),. Які використовували величини V=0,719 см / г і 9S,. Молекулярна маса NA *, виділеної з штаму B / Lee за допомогою обробки віріонів трипсином, дорівнювала 207400. Більш високі константи седиментації були отримані для NA *, виділеної за допомогою обробки детергентом. Webster і Darlington (1969) знайшли цю константу рівний 10,8 S для NA * типу N2 (Х7) (обробка твіном-20), Bucher і Kilbourne (1972) визначили величину константи в 11S для NA * типу N2 (Х7), при її виділенні за допомогою SDS. При виділенні за допомогою SDS NA * вірусу грипу типу А має константу седиментації, рівну 10S, і обробка її проназа знижує цю константу до 9S (Rott et al., 1970). На підставі дослідів, проведених в умовах відновлення, ^ передбачалося, що активною формою NA * є тет-рамер (Kendal, Eckert, 1972; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al.,. 1972). Кілька груп дослідників показали, що активні частинки з константою седиментації 10S можуть диссоциировать на мономери відносною молекулярною масою 50 000-60 000 після обробки відновлюють агентами, такими, жак меркаптоетанол і датіотріетол (Webster, 1970а, b; Skehel, Schild, 1971; Kendal, Eckert, 1972; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972). Тверда впевненість в існуванні тетрамерной структури NA * виникла після публікації Wrigley і співавт. ('1973) Їх електронно-мікроскопічних знімків. На них виділена за допомогою про-теолитическими ферментів NA * виглядає як планарная тет-рамерная частинка, мономер якої являє собою, швидше освіту жубіческой, ніж сферичної, форми з довжиною ребра близько 4 нм (19, см. 35). Якщо тетрамери NA * виділяються за допомогою SDS, то вони зберігають ниткоподібні освіти, або «хвости», довжиною близько 10 нм з потовщенням на 'кінці діаметром близько 4 нм (Laver, Valentine, 1969; Wrigley et al., 1973).

  Тетрамерная структура є необхідною умовою наявності активності NA * (Bucher, Kilbourne, 1972; Kendal, Eckert, 1972). Gregoriades (1972), проводячи досліди з гель-фільтрації в градієнті, виявила ферментативну активність менших, ніж тетрамери, утворень. Однак, як ясно з спостережень Bucher і Kilbourne (1972), в дослідах Gregoriades NA * могла реасооцііроватье освітою тетрамеров вже після елюції при гель-фільтрації. Хоча після хроматографії на колонці з (биогелем А-5 ('фірма «Bio Red» США), NA * і елюіруются у вигляді частинок з відносною молекулярною масою 53 000, фермент здатний до спонтанної реассоціаціі в активні тетрамерние оуб'едініци, що' було показано центрифугированием в градієнті щільності сахарози (Bucher, Kilbourne, 1972). Різні рівні асоціації мономерів із зазначенням їх ферментативної активності наведені на 20.

  Хоча дисульфідні зв'язки і грають велику роль у підтримці тетрамерной структури NA *, ino Мабуть, вони важливі під внутрішньомолекулярних і (або) в междімерних взаємодіях, а не у взаємодіях між усіма чотирма субодиницями (див. 20) (Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972). Bucher і Kilbourne (1972) показали, що дифузія NA * при електрофорезі в поліакріламндном гелі без додавання відновлюють агентів відбувається по

  законам, справедливим для молекул з відносною молекулярною масою вище такої тетрамеров (200 000-250 000). Lazdins і співавт. (1972), проводячи експеримент в невосстанав-лював умовах, 'знайшли для NA * штаму B / Lee смугу, відповідну молекулярної масі в 120 000. Для отримання мономерних субодиниць ь цих дослідах було необхідно відновити дисульфідні зв'язки. Автори цих робіт припустили, що мономери з'єднані один з одним в ді-мірних утвореннях дисульфідними зв'язками, а зв'язки димарів при формуванні тетрамерной структур носять неко-валентний характер.

  Хоча тетрамерная структура NA * в даний 'час твердо встановлена, неясно, чи формується вона чотирма еквівалентними мономерами (Kendal, Eckert, 1972; Wrigley et al., 1973) або двома типами нееквівалентний мономерів (Bucher, Kilbourne, 1972). Припускають, що наявність в молекулі NA * одного або двох типів субодиниць залежить від штаму вірусу. Те, що NA * має булавообразную форму, може означати наявність у її складі більше одного типу макромолекул. Дослідники, які вивчали NA * типу N2, ізольовану з рекомбінантних штамів Х7 і Х7 (F1) за допомогою де-тергентного методу, виявили два компоненти, хоча різні автори дають різні співвідношення між кількістю мономерних одиниць двох типів (Webster, 1970a; Skehel, Schild, 1971; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972). Bucher і Kilbourne (1972) вважають, що мономери існують в NA * в еквімолярних кількостях; інші автори показали нижчу. Концентрацію для компонента з більшою електрофен-ретіческой рухливістю (Skehel, Schild, 1971; Lazdins et. Al., 1972). За даними Kendal і Eckert (1972), до складу NA * реком-бінанта Х7 (F1) входить тільки один тип поліпептиду. Слід, однак, відзначити, що автори ізолювали фермент за допомогою протеолітичного методу. Gregoriades (1972) - виявила лише один вид субодиниць для NA * (N1), виділений з віріонів грипу штаму WSN. При дослідженні. NA *, виділеної з штаму B / Lee, був також виявлений тільки один компонент (Lazdins et arl., 1972; Laver, Baker, 1972; Wrigley et al., 1973).

  Kendal і Kiley (1973) спостерігали тільки одну смугу лоліпептіда при електрофорезі після відновлення NA * Х7 (F1), виділеної з віріонів грипу протеолітичним методом. Пептидні карти тріпсінових гідролізатів NA *, виділеної іротеолітіческім методом, показали наявність тільки одного типу субодиниць. Такий висновок був зроблений на основі підрахунку числа радіоактивних сульфгідрильних груп (Kendal, Kiley, 1973). Після розщеплення трипсином | субодиниць NA *, меченной 14 | С за допомогою карбоксіамідоме-тілірованія, Kendal і Kiley (1973) спостерігали близько 20 пя-

  тен при ауторадіографії пептидних карт, що з великим ступенем ймовірності вказує на присутність в NA * тільки одного типу субодиниць, оскільки в них був знайдений 21 залишок сумарного цистеїну. Якби в NA * існувало два типи субодиниць, то повинно було 'б спостерігатися подвійне (42). Кількість плям. Однак Laver і Baker (1972) виявили тільки 14 цистеїнових залишків. Тому подвійне їх кількість повинна дорівнювати 28, що в межах експериментальної помилки збігається з 20 пептидами, виявленими Kendal і Kiley (1972) на пептидних жарт. Можна також припустити, що число видів пептидів в NA * може залежати від методу виділення ферменту. Однак пептидні карти'NA *, отримані за допомогою обох методів, не показали істотних відмінностей (Kendal, Bucher, неопубліковані дані).

  Lazdins і співавт. (1972) припустили, що у випадках, коли спостерігалося два типи поліпептидів, компонента з більш високою електрофорезяой рухливістю піддавалася про-теолізу. Kendal і Kiley (1973) дотримуються такої ж точки зору. Інше можливе пояснення може полягати у відмінності вуглеводної частини мономерів. З'ясування питання про відмінність двох типів мономерів NA, дійсних чи артефактних, пов'язано з поділом і ізоляцією цих мономерів. Наявність двох типів субодиниць в NA * збільшило б труднощі при її генетичному вивченні і разом с. тим можливий потенціал її генетичної мінливості.

  VIII. Антигенні властивості нейрамінідази

  Нейрамінідазу вважається важливим у антигенному відношенні компонентом віріона. Унікальність NA * вірусу грипу полягає в тому, що вона, будучи ферментом, грає, крім того, роль антигену при захворюванні грипом. Антитіла до NA * можуть створювати захист проти грипу і змінювати перебіг хвороби (див. гл. 12). Використовуючи рекомбінантні штами, що містять поширену нині NA *, і серологічно змінені гемаглютиніни, Schulman і співавт. (1968) показали, що антитіла до NA * інгібують вірусну реплікацію в клітинах легкого миші, зменшують титр вірусу і ступінь ураження легень.

  Як і НА *, NA * схильна антигенними зрушень і дрейфу. Нейрамінідазной компонента віріона змінюється в процесі антигенної мінливості (Paniker, 1968; Schulman, Kilbour-ne, 1969). Хоча новий тип вірусу грипу - тип А2 - виник в 1947 р. і при цьому спостерігалися дуже суттєві зміни НА * нейрамінідазной. Компонента нового типу давала позитивну відповідь у «росс-реакціях з NA * вірусу грипу

  АТ і тому N А * з обох типів вірусу були позначені одним символом - N1 (Paniker, 1968; World Health Organization, 1972). У 1957-1958 рр.. виник новий тип вірусу А2. При цьому утворився як новий НА * (N2), так і нова NA * (N2). Як показав Rafelson і співавт. (1963а, Ь), в цьому випадку крос-реакції між антисироватками до азіатських штамів (N2) і антисироватки до PR8 (N1) або до вірусу грипу В були відсутні. Штам, що виник в 1968 р., володів новим типом НА * (НЗ), а його NA * - високий крос-реактивністю зі штамами вірусу Тріппа А2 і у зв'язку з цим для її позначення був знову використаний символ N2 (World Health Organization, 1972 ). Однак невелика зміна, так званий антигенний дрейф, все ж спостерігалося в 10-річні періоди, що відокремлюють 'кардинальні антигенні зрушення (Schulman, Kilbourne, 1969).

  Взаємодія «ейрамінідази з антитілами може бути вивчена за допомогою декількох методів. До них відносяться такі методики, як інгібування ферментативної активності (Fazekas de St. Groth, 1962, 1963; Aymard-Hanry et al., 1973), іммунопреціпітація (Easterday et al., 1969; Schild, Pereira, 1969; Palese et al. , 1973), визначення зменшення розміру бляшок (Jahiel, Kilbourne, 1966) і тести титрування на мишах (Schulman et al., 1968). Смугу іммунопреціпіта-ції можна спостерігати після проведення иммунодиффузии при використанні ніз'комолекулярного хромофорного субстрату МФН (Palese et al., 1973).

  Найбільш широко поширеною методикою визначення наявності антінейрамінідазних антитіл є реакція гальмування нейрамінідазной активності з використанням високомолекулярних субстратів - глікопротеїдів, що містять нейрамінової кислоту. Рівень інгібування антитілом не залежить від (концентрації субстрату (Fazekas de St. Groth, 1963; Rafelson et al., 1963a). Реакція придушення нейрамінідазной активності була стандартизована, причому в цьому випадку в якості субстрату використовували фетуін, а за ступінь придушення активності-брали величину розведення вихідного розчину антитіл, при якому спостерігається 50% придушення нейрамінідазной активності (Aymard-Hen-ту et al., 1973). Якщо відкладати на графіку відсоток інгібування залежно від логарифма розведення антисироватки, повинна вийти пряма лінія. Звичайні умови проведення цього тесту : 1,2% концентрація фетуіна в 0,1 М фосфатному буфері, рН 5,9 тз присутності 1,5, мМ СаСЬ в обсязі 0,2 мл. Чутливість реакції зросла за рахунок збіль-.. чення часу інкубації нейрамінідази з антисироваткою і субстратом (17 год при 37 ° С).

  Було виявлено, що ступінь інгібування нейрамінідазной активності за рахунок взаємодії з антитілами за-

  висить від розмірів молекули субстрату (Fazekas de St. Groth,. 1963; Rafelson et al., 1963). Така ж залежність спостерігалася і для нейрамінідази Vibrio cholerae (Mohr, Schramm, 1960). Було показано, що нейрамінідазной активність вірусу грипу інгібується специфічними антитілами, якщо: як субстрат використовувати високомолекулярний субстрат (орозомукоід, фетуін або ллікопротеід, виділений, з сечі), і інгібується слабо або взагалі не інгібується при використанні низькомолекулярних субстратів, таких,, як сіаліллактоза . Це вказує «а те, що інгібування активності нейрамінідази-стерическую процес, тобто антитіло взаємодіє ні з активним центром ферменту, а з сусіднім ділянкою (або ділянками), і ступінь інгібірова-ня зростає з ростам відносної молекулярної маси використовуваного в реакції субстрату (Fazekas de St. Grothr 1962).

  Порівнюючи штами вірусу грипу А і В, Fazekas de St .. Groth (1963) виявив, що в вирионах штаму АТ (Mel) нейрамінідаза розташована таким чином, що легкодоступна для нейтралізації антитілами, і-максимальна: ступінь інгібування при використанні одного і того ж субстрату вище для штаму А0 (Ме1), ніж для штаму B / Lee. Для штаму вірусу грипу А2 спостерігалося стеріче-ське інгібування антитілами при використанні високомолекулярних субстратів і слабке - при використанні як субстрату сіаліллактози. На відміну від цього для штаму вірусу грипу В інгібування відсутнє при використанні сіаліллактози, 80% інгібувати при використанні високомолекулярних субстратів (таких, як фетуін, орозомукоід і мукоїд сечі, оброблений трипсином) і 100% при використанні дуже великих субстратів (еритроцити, мукоїд сечі і овомуцін). Це може свідчити про те, що в штамах вірусу грипу В відстань між антигенними і активним центром більше, ніж у штамах грипу А.

  При розщепленні антитіл за допомогою папаїну стеріче-ське інгібування різко зменшується, хоча константа зв'язування антитіл в обох випадках однакова. Крім того, інгібування нейрамінідазной активності носить неконкурентний характер і залежить від: 1) відстані між антигенною детермінантою і активним центром ферменту, 2) розміру і форми молекули субстрату; 3) розміру молекули антитіла. Оцінка величини відстані між антигенними і активним ділянками нейраміяідази дала величину 2 їм (Fazekas de St. Groth, 1962). Ці експерименти-були проведені з антисироваткою до цільної вірусної частці, що містить антитіла як до гемаглютиніну, так і до нейрамінідазі. Для підтвердження наведених вище висновків необхідно провести.

  аналогічні експерименти з використанням моноспеціфіческой сироватки до нейрамінідазі.

  Те, що активний центр ферменту не приймає участі у виробленні антитіл, характерно не тільки для нейрамінідази. Мабуть, це властивість властива деяким іншим ферментам і є показником відсутності мутабельності активного центру у біологічних видів (Cinader, 1967). Одним з пояснень цього феномену може бути те, що, якби організм розпізнавав активний центр вірусної NA * так само, як активний центр своєї власної NA *, він не зміг би виробити антитіла до вірусного ферменту.

  Антитіла до НА * в різного ступеня інгібують активність NA * деяких штамів вірусу грипу (Paniker, 1968; Webster, Pereira, 1968). Інгібування активності NA *, викликане антитілами до НА *, несміливо місця, якщо NA * (Х7) ізолювали з віріона за допомогою твіну-20 (Webster, 1970a), SDS 'або лронази (Easterday et al., 1969). І, навпаки, антитіла до NA * можуть пригнічувати гематтлютінацію деяких штамів вірусу грипу (Kilbourne, 1968; Schulman, Kilbourne, 1969). Однак у більшості випадків антитіла до NA * Не інгібують реакцію гемаглютинації, але ефективно-пригнічують елюція вірусу (Brown, Laver, 1968). Реакція інгібі-ровая. Гемагплютінаціі була використана для виявлення антитіл до NA * рекомбінантов Х15 «Х15 (НК) (Kendal et al., 1972). Чутливість цього тесту була підвищена при використанні IgG-антитіл людини (Kendal et al., 1972) (див. також гол. 11).

  IX. Лектинів І нейрамінідази

  Конканавалін А, будучи лектином і фітогемагллютіні-ном, інгібує, подібно специфічним антитілам, актив-% ність NA * вірусу грипу у випадку, когдавкачествесубстрата: використовують високомолекулярні сполуки, такі, як фе-: Гуїн (Palese et al., 1973; Zalan et al., 1974). Конканавалін А. Агглютинирует речовини, що мають у своєму складі ad-плю-копіранозідние, ad-маннопіранозідние і ia-d-фруктофура-нозідние ядра (Goldstein et al., 1965; Goldstein, 1965). Як і у антитіл, лінія преципітації NA * може бути обготівковув-, ружена при иммунодиффузии з використанням нізжомолеку-лярного хромофорного субстрату МФН, якщо замість антисироватки взяти розчин конканавалін А, а дифузію прово-. дить проти зруйнованого вірусу. Це явище має місце, навіть незважаючи на те, що конканавалін А пригнічує активність NA * при використанні високомолекулярного субстрату (Palese et al., 1973). Таким чином, конканавалін А поводиться подібно антінейрамінідазньщ антитілам, тобто блокує активний центр ферменту безпосередньо, а за рахунок стер'Іческого ефекту.

  jRott і співавт. (1972) продемонстрували преципитацию NA * за допомогою конканавалін А, вважаючи, що цей ефект пов'язаний із взаємодією конканавалін з одним з поверхневих компонентів. Ці автори,. Крім того, показали, що додавання конканавалін А до фібробластам курячого ембріона, інфікованим вірусом FPV, запобігає оборку або відділення вірусу від клітини. Якщо вірус руйнувався за допомогою тритона Х-100, то гемагглютінірующімі активність виявлялася в супернатанті, a NA * випадала в опадах разом з конка'наваліном А. Однак, якщо NA * ізолювали за допомогою протеолітичного ферменту, тільки 7з її осаджувалася «онканаваліном А, а 2 / з залишалися в розчині. Отже, при лротеолітіческом виділення NA * від неї відщеплюється фрагмент з високим вмістом вуглеводів, як це вже було показано Lazdins і співавт. (1972), які використовували у своїй роботі інші методи.

  Раніше Zalan і співавт. (1974) висловили припущення, що активність NA * блокується конканавалін А через взаємодію з гемагглютинином. Однак ізольована NA * блокувалася в тій же мірі і тим же чином, що й NA * in situ.

  Була виявлена ??штаммовие залежність інгібування за допомогою конканавалін А. Ймовірно, вуглеводні залишки NA на поверхні вир іона легкодоступні і вивільнення ферменту не оголювали. Небудь приховані раніше області. Крім того, ізольована NA * може адсорбуватися на сефароза з ковалентно зв'язаним з нею (конканавалін А (фірма «Pharmacia», Швеція), а НА * не володіє такою здатністю (Zalan, персональне повідомлення). Роботи Rott і співавт., А також Zalan показали, що вуглеводні компоненти NA * і iHA * істотно різні.

  Нейрамінідазу, як і НА *, адсорбується колонкою з фі-тогемагглютініном, виділеним з Lens culinaris (Hayman et al., 1973). Цей лектин чутливий до присутності глюкози, манози і стерически подібним їм залишкам Сахаров (Stein et al., 1971). Дослідження з використанням лектинів повинні допомогти з'ясувати локалізацію активного центру в молекулі NA і отримати інформацію про природу її вуглеводної частини.

  X. ІНГІБІТОРИ АКТИВНОСТІ нейрамінідази

  ІнгІ'бірова'ніе активності NA * можна викликати не тільки використовуючи антитіла або лектини, але і за допомогою деяких інших речовин. Інгібітори активності NA * можуть бути як синтетичними, так і природними, низько-або високомолекулярними, високо-і нізкоспеціфічнимі. Інтерес до вивчення інгібіторів пояснюється тим, що вони можуть бути

  використані як хіміотерапевтичні засоби проти вірусів, що містять NA *.

  Речовини, інгібуючі активність NA *, зазвичай не діють на НА *, хоча обидва цих вірусних білка взаємодіють з «ейраміновой кислотою. Сіаліллактоза розщеплюється, NA *, але не є інгібітором гемаглютинації (Bogoch, 1957). Орозомукоід також не пригнічує реакцію гемаглютинації, хоча і розщеплюється NA * (Mayron et al., 1961). ; Нейрамінової кислота пригнічує активність NA *, але не пригнічує гемаглютинації (Odin, 1952).

  У роботах Drzeniek (1966, 1970), Becht і Drzeniek (1967) було покарано, що. Поліаніонна роблять помітний інгібі-ючий дію на вірусну NA *. Рибо-і дезоксірібонук-леіновие кислоти, сульфат декстрану,. Муцин підщелепних залоз свині і гепарин в концентраціях від 0,005 до 0,5 мкг / мл пригнічують активність NA *, виділених з вирио-нов грипу та парагрипу. Синтетичні і неорганічні Поліаніонна, такі, як тріпан червоний, конго червоний, а також фосфовольфрамовой і жремніевольфрамовая кислоти в концентраціях 10 ~ 4 і 10 "7 М також інгібують NA вірусів FPV/Rostock/34 і вірусів грипу А2. Активність цих сполук, однак, не є специфічною, оскільки їх інгібуючу дію елімінується малими колі-- якостями полікатіон, такими як полі-1-лізин.

  Сульфгідрмльние препарати, такі, як тиогликолат, глютатіон, цистеїн, мертіолат і Hg2 +, інгібують активність NA * вірусів грипу штамів А2-Японія/305/57 (H2N2) і PR8 (H0N1), хоча їх концентрація для 50% інгібування має бути досить висока і знаходиться в межах від 10 ~ 2 до 10 ~ 3 М (Rafelson et al., 1963а). Високі концентрації ЕДТА (10 ~ 2-10 ~ 4 М) також надають інгібуючу

  дію.

  Було показано, що 'велика кількість структурно несхожих сполук пригнічує активність NA * вірусів грипу (21). Edmond і співавт. (1966) виявили, що похідні фенілгліоксаля і похідні оксамових кислот інгібують NA * вірусу грипу А/Англія/1/61 (H2N2). Найефективніший інгібітор з цієї групи сполук - N-фе-нілоксамовая кислота - пригнічує ферментативну активність на 50% в концентраціях 2-10 ~ 4-5-10 ~ 4 М. Незважаючи на те що похідні оксамових кислот є неспецифічними інгібіторами NA *, взаємодіючими з ферментами, що не мають відношення до нейрамінової кислоті, наприклад з Лактатдегідрогеназа, амінофенілоксамовая кислота, з'єднана за допомогою ковалентного зв'язку з твердим матриксом, була успішно використана для очищення бактеріальних і вірусних NA * (Cuatrecasas, Illiano, 1971; Bucher, 1973). Деякі із з'єднань, описаних Edmond і співавт. (1966), чинять слабкий антивірусну дію на репродукцію еіріонов штаму PR8 (H0N1) в аллантоісной мембранах, але втрачають цю властивість, коли вірус вирощується на курячих ембріонах. Haskell і співавт. (1970) описали інший клас інгібіторів кислих NA *, що є похідними | 3 -, арил-а-меркаптоакр; мулової кислоти (див. 21). Ці інгібітори на 50% пригнічують дію вірусних і бактеріальних NA * також при відносно високих концентраціях (5-10 ~ 4 М). Інша група інгібіторів NA *, похідні амінофенілбензоімідазолов, цікаві в тому відношенні, що вони є основними на відміну від описаних вище сполук, у всіх молекулах яких міститься карбоксильная група. Однак бензоімідазольние похідні також є відносно слабкими інгібіторами активності NA * (Haskell et al., 1970).

  Похідні дигідро-і тетрагідрохіноліна інгібують активність NA * і є активними протигрипозними препаратами (Brammer et al., 1968; Haskell et al., 1970). Препарати були випробувані на мишах і людях (Brammer et al., 1968). Нещодавно Schinkai і Nishimura (1972) встановили, що хоча досліджені ними два-похідних изохинолина і не інгібують дію NA *, проте їх присутність заважає визначенню активності NA * за допомогою тіобарбітурової кислоти. У світлі цих даних експерименти, проведені Brammer і співавт. (1968), Tute і співавт. (1970), Haskell і співавт. (1970), вимагають додаткової перевірки.

  'Намагаючись створити' специфічні інгібітори NA *, деякі дослідники синтезували сполуки, що є структурними похідними N-ацетілнейраміновой кислоти. Як було показано раніше, сама N-ацетілнейраміновой жи-лота є слабким інгібітором NA * вірусу грипу А / 'Сін-гапур/1/57 (H2N2) з величиною Ки=5-10 ~ 3 М, порівнянної зі значенням Км=6 - 10 "4 М для сіаліллактози. А. Я-Хорлін і співавт. (Khorlin et al., 1970) показали, що 2-дезокси-2-я-нітрофенілтіо-М-ацетил-а-б-нейрамйяовая кислота, а-кето -зид N-ацетілнейраміновой кислоти, є конкурентними інгібіторами NA * Vibrio cholerae з Ки=2,3-10-4 М пр «Км=1,67-10-3 М для N-ацетілнейрамініллактози. Інший аналог нейрамінової кислоти - б ^ лактон 3-азо-2 ,3,4-три-дезокси-4-оксо-с1-арабінооктоновой. кислоти навіть 'більш ефективний (Ки=4-10 "" 5 М) для придушення активності NA * V. cholerae (див. 21 ). Обидва з'єднання володіли інгібі-рующей активністю по відношенню до всіх дослідженим вірусним NA *.

  Нещодавно 'були синтезовані похідні дезоксінейр-аминовой кислоти, що володіють здатністю специфічно блокувати активність NA * (Meindl, Tuppy, 1969a, 1973). Конкурентним інгібітором NA * v. cholerae є 2-дезок-сі-2 ,3-дегідро ^-ацетілнейраміновой кислота. Ця речовина має високу спорідненість ж бактеріального ферменту (Ки=И0-5 М) і здатністю пригнічувати репродукцію мік-совірусов в культурі тканини (Meindl, Tuppy, 1963b; Meindl et al., 1971). 2-дезокси-2 ,3-дигідро-И-ацетілнейраміновой кислота відрізняється від М-ацетілнейраміновой кислоти тільки наявністю подвійного зв'язку між 2-м і 3-м атомами вуглецю. Похідні цього з'єднання, одержувані при заміщенні N-ацетильной групи на N-флуорен-, N-діфлуоро-, N-тріфлу-оро-або N-хлорацетільную групу, є ще більш ефективними інгібіторами (Meindl et al., 1974). Вісімнадцять похідних цього типу були досліджені на інгібуючої-щую активність проти різних NA * вірусів грипу. Найбільш активну похідне - 2-дезокси-2 ,3-дигідро-г \ [-Т'рі-флуороацетілнейраміновая кислота (ФАНК)-конкурентно інгібує активність NA * вірусу грипу A/Mel/35 (HON1) з Ки=7,9 - 10 ~ 7 М. Таким чином, ФАНК - найбільш ефективний з відомих інгібіторів NA *. Спорідненість вірусних NA * до низько-і високомолекулярних субстратів приблизно в

  1000 разів нижче, ніж до ФАНК (Meindl et al., 1974; Schulman, Palese, 1975). ФАНК інгібує активність ферменту '«а 50% при концентраціях порядку 2 - 10 ~ 6-5-10 ~ б М при концентрації субстрату 10 ~ 3М«, ймовірно, специфічна для NA * і реакцій, в яких присутня нейрамінової кислота. Гематглютінацію вірусів грипу типів А і В ФАНК НЕ ін-ги-бірует, але впливає на гемаглютинацію вірусів парагрипу, NDV і SV5 в концентраціях вище Ю-7 і 10 ~ 6 М відповідно. Оскільки проте гемагглютінірующімі активність вірусу Сендай ФАНК не пригнічує, не можна стверджувати, що її властивість інгібувати гемаглютинацію універсально для всіх вірусів парагрипу (Meindl et al.y 1974).

  Нещодавно було показано, що ФАНК інгібує реплікацію вірусу грипу в культурі тканини. ФАНК придушувала репродукцію всіх досліджених вірусів грипу (Palese et al., 1974а; Palese, Schulman, 1975). Проте були виявлені відмінності в чутливості різних штамів до цього інгібітору. Віруси, що мають у своєму складі NA * типу N1. (Вірус, грипу WSN (H0N1) інгібувати по тесту зменшення розміру бляшок при концентрації ФАНК 2-10 ~ 6 - - 4-10 ~ 6, віруси, що містять NA * типу N2 - рекомбінант Х7 (H0N2), вимагали в 50-100 разів більш високих концентрацій ФАНК для отримання тієї ж ступеня інгібування. Те, що віруси, що містять один і той же тип НА * і різні типи NA *, по-різному ингибируются ФАНК, вказує на те,, що антивірусну дію ФАНК полягає у специфічному придушенні активності NA * (Schulman, Palese, 1975). Крім того, цю точку зору підтверджує і те, що ФАНК не впливає на реплікацію інших оболонкових вірусів, таких, як вірус кору або вірус везикулярного стоматиту, що не мають в своєму складі NA (Kilbourne et al ., 1974; Palese et al., 1974a).

  XI. РОЛЬ нейрамінідази

  Більш ніж за 30 років, що минули після відкриття NA: | \ з'явилося кілька теорій, що пояснюють функцію цього ферменту в вирионе. Поряд з можливою фізіологічною роллю, що полягає. У видаленні нейрамінової кислоти муцинов, які є інгібіторами NA *, передбачалося, що в процесі реплікативного циклу вона відіграє певну роль або при проникненні вірусу в «летку, або при вивільненні з клітки знову синтезованого вірусу. Останнім часом з'явилися дані про те, що NA * здійснює ще й четверту функцію - запобігає агрегації утворилися вірусних частинок.

  На самому ранньому етапі досліджень передбачалося, що NA * відповідальна за проникнення вірусу грипу в чутливі клітини після того, як вірус прикріпився до поверхневих молекулам нейрамінової кислоти, а для проникнення віріонів у клітину необхідно відщеплення цієї кислоти (Hirst, 1942). Проти цієї точки зору є декілька заперечень. Вірус з інактивованої за допомогою теплової обробки NA * продовжує проникати в клітку (Faze-kas de St. Groth, 1948), репродукуючи спільно з активним вірусом (Isaacs, Edney, 1950) і беручи участь в генетичній рекомбінації з іншими вірусами (Burnet, Lind, 1954). Видалення NA * за допомогою протеолітичних ферментів мало вплив на інфекційність штаму WSN (H0N1) (Schulze, 1970). Після інгібування активності NA * за допомогою інгібітора ФАНК при концентрації 10 ~ 3М, коли відбувається практично повне придушення активності ферменту, не спостерігається зміна проникнення вірусу в клітину (Schulman, Palese, неопубліковані дані). Антитіла до NA * з впливають на інфекційність вірусу грипу (Seto, Rott, 1966; Jahiel, Kilbourne, 1966; Webster, Laver, 1967; Kilbourne et al., 1968). Всі ці факти свідчать про те, що активність NA * не істотна на ранніх етапах реплікації вірусу грипу. Можна, однак, припустити, що інактивація або видалення NA за допомогою теплової обробки, протеолітичних ферментів, інгібіторів або антитіл в описаних вище дослідах є неповним і що залишкова активність ферменту достатня для здійснення перших етапів репродукційного циклу.

  Hoyle (1950) припустив, що NA * впливає на клітинні субстрати і бере участь в процесі отпочковиванія вірусу від клітинної поверхні. Padgett і Walker (1964) прийшли до такого ж висновку, показавши, що один з варіантів вірусу грипу B / Lee, що володіє низькою активністю NA *, відгалужується від клітин зі швидкістю, меншою, ніж у звичайного вірусу штаму Lee. Зазначений варіант, крім того, мав більш низьку швидкість росту в процесі реплікації. У світлі недавніх експериментів з варіантами вірусу грипу типу А, які відрізняються один від одного за змістом NA * (у 8-10 разів), можна припускати, що кореляція активності NA * зі швидкістю зростання і виходу вірусу з клітини може визначатися типом клітини-хазяїна .

  Якщо варіанти з високим вмістом NA * реплицироваться з більш високою швидкістю в курячих ембріонах і хоріоналлантюісних мембранах, то варіанти з низьким її вмістом реплицироваться до більш високого титру в клані клітин 1-5С-4 (Palese, Schulman, 1974; Schulman, неопубліковані дані) .

  Аргумент на користь того, що NA * бере участь у вивільненні вірусу з «льотки, підтверджується експериментами, в яких антінейрамінідазние антитіла не впливали на адсорбцію вірусу, але придушували вихід знову синтезованого вірусу з клітини (Seto, Rott, 1966; Jahiel, Kilbourne, 1966; . Webster, Laver, 1967; Kilbourne et al., 1968; Compans et al.,. 1969). Передбачалося, що антитіла 'Запобігають відщеплення кінцевих нейрамінової кислот і таким способом блокують відділення вірусних частинок, (прикріплених до молекул «ейраміновой. Кислоти на' клітинній мембрані. Ця схема була підтверджена експериментами, в яких придушення десорбції вірусних частинок у присутності антитіл частково знімалося с. допомогою додавання надлишку бактеріальної NA * (Compans et al., 1969; Webster, 1970a). Becht і співавт. (1971.) не підтвердили ці результати і показали, що. моновалент-ні антитіла NA *, присутні під час одного циклу реплікації вірусу , нездатні 'блокувати відділений] (е вм-Ріоні, хоча і пригнічують активність NA *. Іншого роду експериментальні дані також змушують засумніватися в ключової ролі NA * під час десорбції вірусу. Однакова кількість нейрамінової' кислоти відщеплюється від інфікованих клітин у присутності або за відсутності антитіл до NA. (Dowdle et al., 1974). Максимально активно NA * синтезується задовго до моменту отпочковиванія вірусу (Schlesin-ger, Karr, 1957; Lipkind, Tsvetkova, 1973).

  Зовсім недавно активність бівалентних антитіл NA * була пояснена на основі їх не а'нтінейрамінідазной активності,, а здатності служити містками (або скріпками) міжокремими вирионами (вперше це припустили Kilbourne і Schulman, 1965) і прикріплювати вірусні агрегати до клітинної поверхні (Kendal, Madeley , 1970; Becht et ai. (, 1971; Dowdle et al., 1974). Природно, що це властивість антитіл може бути не єдиним механізмом, за допомогою якого ці антитіла інгібують репродукцію вірусу. На противагу експериментам Becht і співавт. (1971) за допомогою більш чутливого методу редукції розміру бляшок, що припускає наявність багатоциклової вірусної репродукції, було показано, що антитіла до NA * інгібують реплікацію вірусу (Kilbourne et al., 1974). Під час багато-циклової реплікації навіть невелике зменшення врожаю вірусу множиться за рахунок повторення в кожному наступному циклі репродукції. Ці результати вказують на те,, що по 'принаймні частина інгібуючої активності антитіл можна віднести за рахунок специфічного інгібування NA *. Експерименти з ФАНК - низькомолекулярним інгібітором NA *, описані раніше, підтверджують точку зору, що Інги- бированием активності NA впливає на реплікацію вірусів, що містять NA * (Palese et al., 1974a; Schulman, Palese, 1975),

  і вказують на те, що активність NA * все ж істотна для процесу реплікації вірусу.

  Нова теорія ролі вірусної NA *, що полягає в запобіганні вірусної агрегації, була запропонована після проведення експериментів з ts (температурочувствітельной) мутантами вірусу грипу. Ці експерименти вказали ще раз на важливу роль ферменту в циклі реплікації вірусу грипу-(Palese et al., 1974b, c). Sugiura і співавт. (1972) ізолювали ts-мутанти вірусу грипу WSN (HON1), кожен, з яких потрапляв в одну з декількох комплементаціонних груп. Було показано, що два з цих мутантів є нейро-нідазодефектнимі (Palese et al., 1974b). При неперміссівних температурах нейрамінідазодефектние мутанти дають частинки, що містять нейрамінової кислоту в своїй оболонці і утворюють великі агрегати. Раніше було показано,, що оболонка частинок вірусу грипу і ділянки клітинних мембран, де відгалужується вірус, позбавлені нейрамінової кислоти, ймовірно, за рахунок присутності вірусної NA * (Klenk et al., 1970). Було висловлено припущення, що видалення нейрамінової кислоти може бути необхідним етапом складання вірусної частки (Klenk et al., 1970). Результати, отримані за допомогою нейрамінідазодефектних мутантів, вказують на те, що морфологічно інтактні вірусні частинки з нейрамінової кислотою на поверхні своєї оболонки можуть відбруньковуватися від клітини, але роблять це у вигляді агрегатів, а не індивідуальних віріонів (22). У зв'язку з тим що в цьому випадку віріони мають сіалова кислоту на своїй поверхні, НА * сусідніх вірусів можуть «прийняти», вірусний чохол за рецептор і скріпити віріони один з одним, що призведе до утворення великих агрегатів. Цікаві результати були отримані Schulze (1975) при вивченні ефектів, супроводжуючих штучне прикріплення сиаловой кислоти до поверхні вірусу грипу штаму WSN in vitro. Ця процедура також приводила до утворення невеликих агрегатів (див. гл. 3). Спостережуване при цьому збільшення інфекційності вірусу після прикріплення до його-поверхні in vitro сиаловой кислоти можна пояснити об'єднанням неінфекційних віріонів в агрегати по 2-4 частинки. Такий же феномен описали Hirst і Pons (1973).

  Теорія про такої функції NA * припускає, що тільки ті-віруси, які, мають у своєму складі гемаглютинін,. взаємодіє з сіалосодержащім рецептором клітинної поверхні (тобто орто-і параміксовіруси), вимагають наявності нейрамінідази. Цим пояснюється, чому інші відбрунькувалися від поверхні віруси нейрамінідази не містять. Грунтуючись на досить обмежених даних, можна, ймовірно, стверджувати, що такі віруси, 'як РНК-со-що тримають онкогенних віруси, віруси VSV, Сіндбіс і раб-довяруси, містять «а своїй поверхні нейрамінової кислоту (Burge, Huang, 1970; Klenk , Chippin, 1971; Lay, Dues-berg, 1972; Schulumberger et al., 1973; Krantz et al., 1974) .. Включення нейрамінової кислоти в оболонку всіх відбруньковуватися вірусів може відбуватися в процесі їх дозрівання, тільки орто-і параміксовіруси повинні видаляти зі <своїй поверхні нейрамінової кислоту для того,-щоб запобігти агрегацію.

  При вивченні вірусів, що володіють температурочувстві-котельної нейрамінідазою, за допомогою методу електронної: мікроскопії було виявлено, що ці віруси охочіше агрегує один з одним, ніж адсорбуються на рецепторах клітинних мембран, що містять нейрамінової кислоту. Одне з пояснень зазначеного вище фа ^ та може полягати в тому, що під час відбруньковування вир іони 'знаходяться в дуже тісному контакті один з одним на поверхні мембран і при десорбції з клітини залишаються прикріпленими друг «одному, а не переходять на поверхню клітини. На 22 можна бачити феномен агрегації нейрамінідазодефектних мутант-них вірусів, зростаючих при неперміссівних температурах. Подібний ефект можна спостерігати, якщо мутант вирощують при пермісивними температурах у присутності ФАНК, інгібітора нейрамінідазной активності. При цих умовах дія вірусної нейрамінідази пригнічується, а віріони мають у своєму складі рецептори, що містять нейрамінової кислоту, що є причиною їх агрегації (Palese,, Compans, 1975).

  Крім того, функція вірусної нейрамінідази полягає, очевидно, в отщеплении залишків нейрамінової кислоти від клітинних мембран і верств муцина, що запобігає реадсорбції вірусу на цих рецепторах. Цей факт може бути особливо важливим у природному інфекційному процесі, коли вірус взаємодіє з шарами муцина або іншими інгібіторами гемаглютинації. Нейрамінідазу ж-може не тільки дезагреговані вірусні частки, але й запобігати їх адсорбцію на цих глікопротеїдів, що дозволяє віріони інфікувати нові чутливі клітини. Таким чином, нейрамінідаза може здійснювати в реплікативного циклі не одну, а кілька функцій. 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу"
  1.  Кільбурн Е.Д.. Віруси грипу та грип (1978), 1978
      Книга присвячена огляду різноманітних вірусів грипу, їх культивування, біохімії і особливостям молекулярного пристрою. Зміст: Віруси грипу та грип. Структура вірусу грипу. Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін. Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу. РНК вірусів
  2.  Віруси грипу та грип
      Е. Д. Кільбурн (Е. D. KILBOURNE) I. ВСТУП. ГРИП - ЗАХВОРЮВАННЯ З Незмінних симптоматики, викликає Змінюється ВІРУСОМ Величезний інтерес, який притягається до сучасної вірусології до грипу і вірусів, відповідальним за його виникнення, вимагає пояснення, якщо врахувати ординарний характер симптоматики цього, зазвичай дуже помірного, інфекційного захворювання дихальних шляхів
  3.  Структура вірусу грипу
      П. В. ШОППІН І Р. В. КОМПАНС (PW CHOPPIN, Я. W. COMPANS) I. ВСТУП Вивчення вірусу грипу протягом тривалого часу перебувало «а передовому рубежі структурних досліджень у вірусології. Вірус грипу одним з перших був вивчений: допомогою електронної мікроскопії (Taylor et al., 1943), і при використанні саме цього об'єкта в якості моделі було "вчинено, що деякі віруси
  4.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін
      І. Т. ШУЛЬЦ (I. Т. SCHULZE) I. ВСТУП ТОЙ факт, що віруси грипу мають здатність агглютинировать еритроцити, відіграв велику роль у розвитку наших уявлень про ці інфекційних частинках. Гемаглютинація виявилася вкрай зручним методом для ідентифікації, очищення і визначення. Концентрації вірусів. Крім того, з (моменту виявлення явища гемагглю-тінаціп 35 років тому
  5.  Реплікація вірусу грипу
      К. ШОЛТІССЕК і Х.-Д. Кленк (пор. SCHOLTISSEK, H.-D. KLENK) I. ВСТУП З проблеми реплікації вірусу грипу існує ряд оглядів. Література до 1968 р. узагальнена в статтях Hoyle (1968) 'і Scholtissek (1969); пізнішими роботами є огляди White (1973), а також Compans і Choppin (1974). Більшість даних по реплікації отримано при 'вивченні вірусу грипу типу А. Істотних
  6.  ПРИНЦИПИ ВІРУСОЛОГІЇ
      Кеннет Л. Тайлер, Бернард Н. Філдс (Kenneth L. Tyier, Bernard N. Fields) Структура і класифікація вірусів. Типова вірусна частка (вирион) містить ядро, що складається з нуклеїнової кислоти - ДНК або РНК. Існує значна варіабельність структур і розмірів вірусних нуклеїнових кислот (табл. 128-1). Геноми з мінімальною мовляв. масою, як, наприклад, у парвовирусов, налічують 3-4
  7. Г
      + + + Габітус (лат. habitus - зовнішність, зовнішність), зовнішній вигляд тварини в момент дослідження. Визначається сукупністю зовнішніх ознак, що характеризують статура, вгодованість, положення тіла, темперамент і конституцію. Розрізняють статура (будова кістяка і ступінь розвитку мускулатури): сильне, середнє, слабке. Вгодованість може бути гарною, задовільною,
  8. Н
      + + + Гній, цінне органічне добриво, що складається з екскрементів тварин, рідких відходів ферм і підстилкового матеріалу (солома, торф, тирса). Н. містить велику кількість мінеральних і органічних речовин, внесення яких в грунт підвищує її поживні властивості. Залежно від методу утримання тварин та системи збирання приміщення розрізняють Н. рідкий, напіврідкий і твердий. Рідкий
  9. П
      + + + Падевий токсикоз бджіл незаразна хвороба, що виникає при харчуванні бджіл (падевим медом і супроводжується загибеллю дорослих бджіл, личинок, а в зимовий час і бджолиних сімей. Токсичність падевого меду залежить від наявності в ньому неперетравних вуглеводів, алкалоїдів, глікозидів, сапонінів, дубильних речовин, мінеральних солей і токсинів, що виділяються бактеріями і грибами. Потрапляючи в середню
  10.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу
      Р. В. ОІМПСОН і В. Д. БІН (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. ВСТУП Ця глава «освячена досить новому розділу в біології вірусу грипу, у зв'язку з чим більша частина інформації фрагментарна по-своєму складу сі включає велике число невирішених питань. Основне твердження, на якому грунтується дана глава, полягає в тому, що мікоовіруси є вірусами з негативним геномом
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...