загрузка...
Патологічна фізіологія / Оториноларингологія / Організація системи охорони здоров'я / Онкологія / Неврологія і нейрохірургія / Спадкові, генні хвороби / Шкірні та венеричні хвороби / Історія медицини / Інфекційні захворювання / Імунологія та алергологія / Гематологія / Валеологія / Інтенсивна терапія, анестезіологія та реанімація, перша допомога / Гігієна і санепідконтроль / Кардіологія / Ветеринарія / Вірусологія / Внутрішні хвороби / Акушерство і гінекологія
« Попередня Наступна »

Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін

І. Т. ШУЛЬЦ (I. Т. SCHULZE)



I. ВСТУП

ТОЙ факт, що віруси грипу мають здатність агглютинировать еритроцити, відіграв велику роль у розвитку наших уявлень про ці інфекційних частинках. Гемаглютинація виявилася вкрай зручним методом для ідентифікації, очищення і визначення. Концентрації вірусів. Крім того, з (моменту виявлення явища гемагглю-тінаціп 35 років тому (Hirst, 1941; McClelland, Hare, 1941) вважається, що механізми адсорбції вірусів грипу на поверхню клітини-господаря і на поверхню еритроцитів подібні. Отже, на з'ясування питання про. тому, жакім чином віріони грипу ініціюють інфекційний процес, у великій мірі впливають наші знання. механізму взаємодії цих шіріонов з еритроцитами.

Протягом декількох років після відкриття гемагглютіна-ції Hirst (1941, 1942а, Ь) з'ясовував основні закономірності цього явища. Було виявлено, що гемагглютинация може бути використана не тільки для виявлення вірусу грипу, але і для визначення його концентрації, оскільки має 'місце пропорційність між гемагглютінірующей активністю препаратів та їх летальною дозою для мишей. Крім того, обробка аллантоісной рідини еритроцитами призводить до паралельного зменшення її інфекційного титру і титру гемаглютинації. Було також показано, що конвалесцентная сироватка крові, що нейтралізує інфекційність, гальмує і гемаглютинацію. Таким чином, були отримані прості та ефективні експрес-методи для кількісної оцінки вмісту вірусів і вирусспецифических антитіл.

Hirst показав також, що адсорбовані на еритроцитах віруси можуть бути елюіровать при температурі 37 ° С, а елюіровать віруси можна знову адсорбувати на свіжих еритроцитах. Однак еритроцити, з яких вірус був елюіровать, втрачають здатність адсорбувати на своїй поверхні віруси грипу того ж штаму. Після м'якої теплової обробки вірусні частки втрачають здатність до елюції без зміни гемагглютінірующей активності. Ці експериментальні дані вказують на руйнування специфічного рецептора клітинної поверхні ферментом, асоційованим з вірусною часткою. Вивчення природи цього рецептора (Hirst, 1948a, b; 1949a , b) довело, що він є мукопротеїдів, подібним з інгібіторами гематглютінаціі, які до того часу були виявлені у звичайній сироватці крові (Hirst, 1942b; McCrea, 1946; Burnet, McCrea, 1946; Francis, 1947).

Експерименти, проведені Hirst, були першим аргументом на користь існування нейрамінідази, що входить до складу віріона (більш докладні дані про неї будуть приведені в гол. 4). Оскільки в описаних дослідах було показано, що процес елюції не робить впливу на самі віріони, фактично був розроблений метод очищення і концентрування вірусу грипу. Деталі такого методу, що включає цикли адсорбції і елюції, були відпрацьовані незабаром після проведення цих експериментів. (Hare et al., 1941, 1942; Francis, Salk, 1942). Метод використовується до теперішнього часу.

З відкриттям явища гемаглютинації почалася нова сторінка в історії вірусології. Невідповідність між інфекційним титром і кінцевою точкою титрування в реакції гемаглютинації призвело von Magnus (1951) до відкриття існування генетично неповноцінних віріонів, дефектних интерферирующих вірусних частинок, названих фон-магнусовскім вірусом.

В даний час відомо, що молекулярними структурами, відповідальними за гемагглютінірующімі активність вірусу грипу, є рівномірно розподілені радіальні поверхневі виступи, утворені субодиницями гликопротеида (див. гл. 2) . Видалення цих виступів призводить до втрати інфекційності та гемагглютінірующей активності. Таким чином, взаємодія гемаглютиніну з клітинною мембраною є першим етапом інфекційного циклу. Однак, як буде показано в гол. 4, можуть бути підібрані умови, при яких віріони здатні викликати інфекційний процес і при цьому не агглютинировать еритроцити. Основне завдання даної глави полягає в тому, щоб дати уявлення про всіх біологічних властивості асоційованого з вірусною часткою гемаглютиніну і пов'язати ці властивості з його структурою. Буде ще раз розглянуто схожість між адсорбцією віріонів на клітину-господаря і на еритроцити. Для вирішення цих завдань буде описана сама реакція гемаглютинації, а також будуть наведені загальноприйняті відомості про структуру гемаглютиніну і його властивості як у складі віріона, так і після ізоляції з вірусної частинки.

II. РЕАКЦІЯ гемаглютинацію

А. ХІМІЧНИЙ СКЛАД РЕЦЕПТОРА ЕРІТРОЦИТІВ ЛЮДИНИ

Віруси грипу агглютинируют еритроцити за рахунок взаємодії з гликопротеидом, до складу якого входить сіалових кислота і який є компонентом мембрани еритроцитів. Цей вірусний рецептор був ізольований з строми еритроцитів людини, а хімічний склад я фізичні властивості його були детально вивчені Winzler і співавт. (1969а). Рецептор є гликопротеидом, що містить М-і N-групові антигени крові (Kathan, Winzler, 1963; Моrawiecki, 1964; Kathan, Adamany , 1967). Рецептор, ізольований з клітки, є високоефективним інгібітором гемагглютінірующей активності вірусу грипу.

У табл. 8 наведені властивості ізольованого рецептора і сіалоглікопептіда, відщеплюється від N-кінця молекули рецептора за допомогою трипсину. отщепляют глікопептид не володіє інгібуючої активністю, хоча він і містить велику частину сиаловой кислоти, гексози і гексозаміна, що входять до складу нерасщепленного вірусного рецептора (Winzler et al., 1967). Лоліпептідная частина рецептора становить тільки близько 18% його маси. Майже половина амінокислотних залишків представлена сер іншому і треонін. Вуглеводні ланцюжка приєднуються до цих двом амінокислотами за допомогою О-гликозидной зв'язку. З аспарагін вони пов'язані N-гликозидной зв'язком. Залишки сиаловой кислоти займають у вуглеводних ланцюжках концевое положення і можуть бути отщепляя від рецептора за допомогою вірусної нейрамінідази (Kathan, Winzler, 1963). Відщеплення сиаловой кислоти від молекул рецептора призводить до придушення їх здатності пригнічувати гемаглютинацію і здібності бути М-і iN-груповими факторами крові (Springer, An-sell, 1958). У разі відсутності в середовищі детергентів спостерігається агрегація інтактних молекул з утворенням агрегатних форм з молекулярною масою близько 590 000. Інгібіторна активність, а також М-і N-групова активність, крові збільшується при агрегації (Springer, 1967). Передбачається, що схильність до агрегації пояснюється гидрофобной природою карбоксильного кінця рецептора. За допомогою обробки трипсином ( Winzler, 1969a) і ціанідом брому (Маrchesi et al., 1972) від С-кінця може бути отщепляя поліпептид, до складу якого входять в основному гідрофобні амінокислотні останки і який не розчиняється у водній фазі. Winzler (1969а, Ь) припустив, що вірусні рецептори приєднуються до мембрани еритроцитів за допомогою гідрофобних областей карбоксильних кінців і що сіалопептіди, розташовані на N-кінцях, локалізуються у водній фазі, навколишнього еритроцит, де вони можуть вступати у взаємодію з вірусом грипу, антитілами проти М-і N-анти-генів і трипсином. Визначивши кількість молекул сиаловой кислоти, відщеплюється від еритроцитів при обробці трипсином, Winzler підрахував, що кожен людський еритроцит містить на своїй поверхні близько 106 молекул сіалопептіда. Однак число рецепторних точок еритроцита, ймовірно, менше числа молекул рецептора.

Howe і співавт. (1970) виявили, що мічені феритину антитіла до очищеного рецептора не розподіляють рівномірно по поверхні інтактних клітин, а приєднують ся тільки до дискретних областям. Таким чином, рецепторні молекули, ймовірно, групуються в своєрідні «кластери», формуючи на поверхні еритроцитів області, що зв'язують вірус.

Б. ВЗАЄМОДІЯ ВІРУСІВ ГРИПУ з еритроцитами

Присутність сіалових кислот на поверхні еритроцитів, мабуть, є необхідною умовою адсорбції на них вірусів грипу, оскільки повне видалення їх призводить до того, що еритроцити стають нездатними до аглютинації (Hirst, 1950). Вірусні частинки також втрачають здатність зв'язуватися з штучними мембранами, освіченими фосфатидилхолін і гликопротеидами, якщо отщепить від їх глікопротеідной частини сіалова кислоту (Tiffani, Blough, 1971). Кількість сиаловой кислоти, необхідної для зв'язування, однак, варіює в різних штамах. Віріони різних штамів можуть бути побудовані в певні ряди по своїй здатності агглютинировать еритроцити, з яких були елюіровать віріони інших штамів (Burnet et al., 1946) .

Визначальна роль залишків сиаловой кислоти в процесі приєднання віріонів до еритроцитів була показана в експериментах, проведених Suttajit і Winzler (1971). Від полігідроксільних бічних ланцюжків залишків сиаловой кислоти в гликопротеидом можуть бути отщепляя один або два атоми вуглецю за допомогою м'якого периодатного окислення з подальшим відновленням за допомогою бортідріда натрію. Отримані таким способом модифіковані глікопротеїди володіють різко зниженою здатністю до інгібування гемаглютинації. Метилирование карбоксильної групи сиаловой кислоти також знижує інгібіторні властивості глнкопротеіда (Kilbourne et al., 1972). Таким чином, на адсорбцію вірусу на еритроцитах, ймовірно, впливають як зарядові, так і загальні конфігураційні властивості рецепторного глікопротеїду.

У деяких видах еритроцитів в процесі адсорбції віріонів беруть участь містять сіалова кислоту вірусні рецептори, що відрізняються від описаних рецепторних гликопротеидов. За даними Winzler (1969a), віруси грипу зберігають здатність агглютинировать людські еритроцити, з яких сіалопептіди видаляють за допомогою обробки трипсином. Оскільки відомо, що ліпосоми, що містять гангліозиди, можуть зв'язувати один з парамиксовирусов - вірус Сендай (Haywood, 1974), цілком імовірно, що саме сіалізідірованние гліколіпіди, що знаходяться на поверхні еритроцитів, можуть бути причиною адсорбції віріонів грипу. Haywood припустила, що рецепторні центри можуть не містити гликопротеидов, якщо до їх складу входять гангліозиди. Вона вважає, що ці гліколіпіди при відповідній їх орієнтації на мембрані еритроцита можуть створити упорядкований шар молекул сиаловой кислоти, необхідний для вірусрецепторной активності. Однак вільна сіалових кислота, вільні гангліозиди і невеликі вуглеводи, що містять сіалова кислоту, що не інгібують гемаглютинацію (Hughes, 1973; Haywood, 1974).

В даний час є ще один доказ того, що молекули, що не містять у своєму складі залишків сіалових кислот можуть грати роль в адсорбції вірусних частинок на еритроцитах. Деякі штами вірусу грипу не елюіруют з еритроцитів, хоч і отщепляют сіалова кислоту від клітин, на яких вони були адсорбовані ( Tsvetkova, Lipkind, 1966), і, навпаки, віруси можуть елюіровать з деяких клітин при відсутності реєстрованого відщеплення сиаловой кислоти (Tamm, 1954). Тоді як процес зв'язування визначається тільки вмістом сиаловой кислоти в рецепторах, швидкість елюції вірусу повинна визначатися величиною нейрамінідазной активності вірусної частинки. Це не завжди так (Choppin, Tamm, 1959, 1960; Tsvetkova, Lipkind, 1966).

Отримані дані дозволяють зробити висновок про те, що для аглютинації, крім взаємодії клітинних рецепторів з залишками сиаловой кислоти, потрібно ще й взаємодія їх з компонентами клітинної мембрани. Ступінь взаємодії вірусів і еритроцитів, ймовірно, залежить як від загальної архітектоніки зв'язують клітинних центрів, так і від структури вірусного гемаглютиніну. Таким чином, достатньою умовою гемаглютинації, по всій видимості, є входження до складу даного центру необхідного числа залишків сиаловой кислоти, а також наявність структурної комплементарності між клітинною мембраною і вірусним гемагглютинином (Fazekas de St. Groth, Gottschalk, 1963; Springer et al., 1969).

В. МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ ВІРУСІВ І АНТИТІЛ, ЗАСНОВАНІ НА гемаглютинацію

1. Кількісне визначення гемаглютинації

У зв'язку з великим числом рецепторних молекул на поверхні еритроцита до кожної еритроцитарної клітині може приєднатися велике число часток вірусу грипу. Було підраховано, що один еритроцит морокою свинки може адсорбувати на своїй поверхні близько 7000 вірусних частинок (Bateman et al., 1955). Однак, якщо в системі існує обмежене число віріонів, вірусні частинки і еритроцити утворюють агрегати, в яких обидва учасники реакції присутні в співвідношенні 1-20 вірусних частинок на один еритроцит (Tyrrell, Valentine, 1957; Seto et al., 1961; Hoyle, 1968).

Ступінь гемаглютинації, спостережувана з даними кількістю вірусу, залежить від типу еритроцитів, штаму вірусу, а також від температури, рН та іонного складу середовища. Тип використовуваних ерітроцітних клітин є головним чинником, що визначає наявність або відсутність гемаглютинації. В реакції можуть бути використані еритроцити хребетних тварин - птахів, амфібій і ссавців ( Hoyle, 1968). Ступінь аглютинації клітин і кількість вірусу, який вони здатні адсорбувати, варіює залежно від виду, до якого належить тварина, та індивідуального представника даного виду.

Вірусні частинки також розрізняються за своєю здатністю викликати гемаглютинацію. Таким чином, кількісний опис реакції гемаглютинації залежить від наявності детальних відомостей про всіх компонентах використовуваної системи. Наприклад, віріони знову ізольованих штамів грипу (тобто штами, які пройшли тільки кілька пасажів в лабораторії) часто мають филаментозному форму, в той час як форма віріонів широко використовуваних лабораторних штамів зазвичай сферична. Вірусні частинки филаментозному форми можуть теоретично агглютинировать більше число еритроцитів; таким чином, ступінь спостережуваної аглютинації не обов'язково відображає кількість присутніх в системі вірусних частинок.

  Для всіх вірусних штамів спостережувана ступінь аглютинації залежить від двох протилежних реакцій - адсорбції та елюції. Оскільки для адсорбції необхідні зіткнення між еритроцитами та вірусними частинками, швидкість цієї реакції визначається концентрацією реагентів і майже не залежить від температури. З іншого боку, елюція звичайно являє результат ферментної деструкції і тому є температурозависимого процесом. Вірусні штами, що володіють низькою нейрамінідазной активністю, можуть бути виявлені по реакції гемаглютинації при 20 ° С. Для штамів ж з високою активністю нейрамінідази швидкість елюції при 20 ° С може бути досить висока, так що аглютинація може і не спостерігатися. Ефект аглютинації для таких вірусів може виявлятися-при 4 ° С або при 20 ° С після деструкції вирионной нейрамінідази с (допомогою м'якої теплової обробки (Hirst, 1948b; Stone, 1949).

  Розроблено велику кількість різних методик для виявлення гемаглютинації, индуцируемой вірусними частинками. Зазвичай кратні розбавлення вірусу инкубируют спільно зі стандартною суспензією еритроцитів і наявність гемаглютинації виявляють візуально (Salk, 1944) або за допомогою денситометрії. В останньому випадку спектрофотометричні вимірювання суміші вірусів з еритроцитами проводять після стандартного періоду інкубації для формування осаду (Hirst, Pickels, 1942; Levine et al., 1953; Horsfall, 1954; Drescher, 1957). Зовсім недавно розроблена методика, згідно з якою агглютинацию виявляють кількісно за допомогою визначення кількості гемоглобіну, що вивільняється з еритроцитів, що не зазнали аглютинації даними розведенням вірусу (Cohen, Belyavin, 1966). Кількість гемоглобіну визначали і реєстрували за допомогою автоматичного аналізатора. Крім того, розроблені методики визначення концентрації субодиниць гемаглютиніну (Drescher, 1966, 1967).

  З усіх описаних методик найбільш часто застосовують пряме візуальне визначення кінцевої точки титрування по картині аглютинації. При цьому зазвичай використовують еритроцити курчати і кратні подвійні розведення в пробірках або в лунках пластмасових пластин (при цьому реакція може бути проведена в мікрообсязі). Коли необхідно провести більш точне визначення, або використовують метод кратних розведень, розроблений Horsfall і Tamm (1953), або визначають кінцеву точку аглютинації за допомогою денситометра. Стандартна помилка кінцевого вірусного титру, визначеного методом кратних розведень, становить приблизно 17% (Horsfall, Tamm, 1953). Drescher (1957) показав, що при використанні спектрофотометрической методики помилка складає 3%.

  2. Гемадсорбції

  У зв'язку з тим що віріони Тріппа відокремлюються від клетокпутем відбруньковування, вірусний гемаглютинін, локалізований на поверхні інфікованих клітин, може бути виявлений до сформування вірусних частинок. Титр вірусу можна розрахувати за допомогою: а) методу, заснованого на зв'язуванні еритроцитів з Кленк шляхом визначення кінцевої точки титрування (Shelokov, 1958), б) підрахунку центрів в монослое клітин, покритих адсорбованими еритроцитами (Hotchin et al., 1960), в) відділення фракції клітин з адсорбованими на них еритроцитами (White et al., 1965); г) визначення кількості гемоглобіну в еритроцитах, адсорбованих на інфікованих клітинах (Finter, 1964). Останні дві методики не вимагають, щоб в інфікованих клітинах згодом синтезувалися повноцінні вірусні частки! Ці методики використовували для виявлення гемаглютиніну на поверхні клітин HeLa при абортивної інфекції, спричиненої вірусами грипу (Wong, Kilbourne, 1961; White et al., 1965), і для виявлення синтезу гемаглютиніну температур © чутливих мутантів при неперміссівних температурах (Mackenzie, Dimmock, 1973 ).

  3. Інгібування гемаглютинації

  Реакція гемаглютинації ингибируется як антитілами, специфічними для вірусного гемаглютиніну, так і низкою розчинних гликопротеидов, що виявляються в сироватці. Крові та інших рідких субстанціях організму. Гальмування гемаглютинації, обумовлене або специфічними антитілами, або неспецифічними речовинами, виражається кількісно за допомогою методу, заснованого на змішуванні стандартного кількості вірусних часток з кратними разведениями досліджуваної сироватки і подальшим додаванням в систему еритроцитів, і розрахунком титру інгібітора по найбільшому розбавленню сироватки, повністю переважної гемаглютинацію. Неспецифічні інгібітори гемаглютинації, присутні в різних концентраціях у більшості сироваток, необхідно видалити або зруйнувати перед визначенням кількості специфічних антитіл. Для цієї мети зазвичай використовують нагрівання, обробку нейрамінідазою, трипсином або перйодати. Неспецифічні інгібітори можна видаляти за допомогою ионообменников (Kilbourne et al., 1972b). Оскільки всі зазначені види обробки можуть, крім того, знизити концентрацію специфічних антитіл, використовуваний метод попередньо повинен бути перевірений на вже дослідженому штамі вірусів і вивченому типі сироватки.

  Г. ВЗАЄМОДІЯ ВІРУСІВ ГРИПУ З НЕСПЕЦІФІЧЕСКММІ ІНГІБІТОРАМИ гемаглютинацію

  Хоча присутність в сироватці неспецифічних інгібіторів і створює додаткові труднощі при визначенні кількості специфічних антитіл, проте їх властивість блокувати гемаглютинацію можна використовувати для вивчення механізму взаємодії вірусів з еритроцитами. Неспецифічні інгібітори поділяються за своїм хімічним складом і властивостями на? -,? - І?-Інгібітори (Krizanova, Rathova, 1969). Один з них -?-Інгібітор, або «інгібітор Френсіса» (Francis, 1947), охарактеризований найбільш повно. Він являє собою містить сіалова кислоту гликопротеид, який інгібує гемаглютинацію, але не впливає на інфекційний процес. Його активність різко знижується при обробці нейрамінідазою, але не зникає після прогрівання при 56 НС протягом 30 хв. Інгібітор?-Типу, або «інгібітор Чу» (Chu, 1951), ймовірно, не містить залишків сіалових кислот; він інактивується нагріванням при 56 ° С протягом 30 хв, але не втрачає свою активність при обробці нейрамінідазою.

  Чи розрізняються інгібітори? - І?-Типів настільки, щоб виправдано відносити їх до різних класів, є предметом дискусії (Kjlbourne et al., 1972b). Відповідно до класифікації, запропонованої Krizanova і Rathova (1969), інгібітори?-Типу на відміну від?-Інгібіторів инактивируются нейрамінідазою. Однак обробка нейрамінідазою може повністю знизити активність даного інгібітора для одного штаму вірусу без зміни його активності для іншого штаму. Крім того, даний гликопротеид може інгібувати гемагглютінірующімі активність двох вірусних штамів і знижувати інфекційність тільки одного з них. Таким чином, до якого типу віднести виявляється інгібітор, частково залежить від штаму використовуваного для визначення активності інгібітора вірусу. У зв'язку з тим що в таких дослідженнях використовували велику кількість різних штамів вірусів, питання про відмінності між? і?-інгібіторами в даний час є в деякій мірі спірним. Choppin (Kjlbourne et al., 1972) запропонував, щоб інгібітори характеризувалися за джерелом виділення і за відмінностей в хімічних і фізичних властивостях (якщо ці відмінності відомі), а не за типами інгібування, спостережуваного для даного штаму вірусу.

  Велика плутанина в даний час існує в питанні про роль інгібіторів в нейтралізації вірусу. Оскільки передбачається, що рецептори на поверхні клітини-господаря і еритроцитів однакові то складом, інгібітори гемаглютинації повинні також знижувати інфекційність вірусу. Віріони з приєднаними ж ним молекулами «-інгібітора не повинні адсорбуватися на центри мембрани клітини-хазяїна, що містять у своєму складі сіалові кислоти, за рахунок зарядового відштовхування і стеричних ефектів. Однак, оскільки відомо, що віріони грипу Інфекційна в присутності?-Інгібітора, було припущено, що адсорбція вірусів здійснюється вже після того, як Віріонна нейрамінідаза зруйнує комплекс між вірусною часткою і молекулою інгібітору (Kjrizanovs, Rathova, 1969). Можна було б очікувати, що, якщо інгібітори а-тина і будуть знижувати інфекційність вірусів грипу, це буде справедливо для штамів з низькою нейрамінідазной активністю. Як описано в тл. 4, інфекційність віріонів, що не володіють реєстрованої нейрамінідазной активністю, збільшується під дією принаймні одного інгібітора гемаглютинації, що містить сіалові кислоти. Тому не активність нейрамінідази, а, ймовірно, якесь інше властивість віріонів відповідально за ті відмінності, які спостерігаються при їх контакті з еритроцитами і клітиною-господарем. Наші спроби вивчити рецептори клітини-хазяїна, використовуючи інгібітори гемаглютинації, можуть бути подібні з знаходженням правильного рішення при збиранні розірваної картинки за умови, що ми не знаємо, чи всі наявні фрагменти повинні бути використані для отримання закінченого зображення. Насправді, мабуть, ми вже поставили деякі фрагменти картинки в неправильне положення. Наприклад, ми, ймовірно, не повинні розглядати залишки сиаловой кислоти як істотну частину структури клітинних рецепторів до тих пір, поки не спробуємо використовувати для вивчення необхідних умов адсорбції вірусу не еритроцити, а саму клітину-господаря.

  III. СТРУКТУРА гемаглютиніну

  Загальні аспекти структури вірусу грипу, включаючи поліпептидний склад віріона, (були вже розглянуті в гл. 2. Тут ми зупинимося тільки на спеціальних питаннях структурної організації гемаглютиніну. Зокрема, будуть розглянуті методи очищення цього гликопротеида, хімічний склад субодиниць, що формують гемаглютинін, а також тривимірна структура активної форми цієї молекули.

  А. ВИДІЛЕННЯ І ОЧИЩЕННЯ гемаглютиніну

  Для руйнування віріонів грипу використовують велику кількість детергентів: нонідет - Р40, тритон XI00, дезоксихолат натрію, Саркозі NL30 і додецилсульфат натрію (SDS). Порогова концентрація міцелоутворення перших чотирьох детергентів досить низька і тому використовувані для руйнування вірусу водні розчини їх не денатурують більшу частину білків. З іншого боку, SDS використовують у досить високих концентраціях, при яких виникають денатураціонние зміни в більшості білків. Однак, незважаючи на це, тим агглютинин деяких штамів вірусу зберігає свою активність при контакті з SDS (Laver, 1963). Одна з перших методик для відділення гемаглютиніну від нейрамінідази без використання протеаз була заснована саме на цій високій стабільності гемаглютиніну (Laver, 1964). Додецилсульфат натрію денатурованого вірусні білки, відмінні від гемаглютиніну, які мігрували при рН 9,0 як аніони, в той час як гемаглютинін мігрував як катіон. Таким чином, гемаглютинін міг бути очищений за допомогою електрофорезу на ацетаті целюлози. За допомогою цієї методики був очищений гемаглютинін вірусу грипу штаму Bel, і для нього була отримана велика інформація, описана в цьому розділі.

  На жаль, зазначена методика не може бути використана для всіх штамів вірусу грипу. Гемаглютинін більшості штамів денатурує в присутності SDS. При використанні ж інших детергентів НЕ денатурує ні гемаглютинін, ні нейрамінідаза, але вони не розділяються при електрофорезі. Гемаглютинін з цих штамів може бути ізольований в чистому (вигляді тільки після отримання рекомбінантов з SDS-чутливої ??нейрамінідазою. У зв'язку з цим виділення гемаглютиніну з більшості штамів вірусу є досить складним завданням.

  Гемаглютинін штаму Х-31, рекомбінантов H0N1-H3N2, який отримав гемаглютинін і нейрамінідазу від H3N2-po-дителя (Kilbourne, 1969), був витягнутий з вірусу за допомогою бромелайна і очищений за допомогою ультрацентрифугирования (Brand, Skehel, 1972). Гликопротеид, очищений таким чином, утворював кристали при вакуумному діалізі проти дистильованої води. Цей метод був успішно апробований для деяких штамів вірусу грипу А і В. Однак чисті білки, отримані цим способом, ймовірно, відрізняються від білків, присутніх в вирионе, як за своєю структурою, так і по функції.

  Нещодавно були розроблені дві методики, в яких для руйнування вірусу використані неденатурірующіе детергенти з наступною хроматографією продуктів фрагментації віріонів на DEAE-целюлозі в присутності низьких концентрацій детергентів для підтримки компонентів у неагрегірованном вигляді (Gregoriades, 1972; Stanley et al., 1973b). Ці методики ще не знайшли широкого розповсюдження, проте з теоретичних міркувань вони повинні мати переваги перед методам з використанням SDS для руйнування вірусних частинок з подальшим електрофорезом. У зв'язку з тим що при використанні описуваного методу розділення з одного і того ж вірусного препарату ізолюються як гемаглютинін, так і нейрамінідаза, можна очікувати, що метод з використанням DEAE-целюлози знайде широке застосування для виділення з великого числа штамів препаративних кількостей вірусних антигенів.

  Б. ХІМІЧНИЙ СКЛАД Субодиниця гемаглютиніну

  Гемаглютинін становить 25-35% всіх білків віріона. Ці дані були отримані при аналізі електрофоретичних профілів в поліакриламідному гелі, отриманих для поліпептидів чотирьох штамів вірусу грипу типу А, культивованих на різних клітинах-господарях (Schulze, 1973). Близько 6% сухої маси вірусу становлять вуглеводи (Ada, Perry, 1954; Frommhagen et al., 1959), більша частина яких асоційована з гемагглютинином. Таким чином, гемаглютинін являє собою гликопротеид, 15-20% сухої маси якого представлені вуглеводами. Гемаглютинін формується з субодиниць гликопротеида з молекулярною масою близько 80000, який був позначений символом НА (Kilbourne et al., 1972а; див. також гл. 2). Оскільки хімічний склад олігосахаридів, асоційованих з вирионом, визначається клітиною-господарем, віріони, культивовані на різних клітинах-господарях, містять молекули гемаглютиніну, що розрізняються за своїми розмірами (Compans et al., 1970b; Haslam et al., 1970; Schulze, 1970) .

  За певних умов вирощування вірусу з субодиниці НА шляхом її протеолітичного розщеплення формуються два гликопротеида HAi і НА2. Фактори, що визначають наявність такого розщеплення, обговорюються в гол. 2 і 8. Розщеплення не є необхідною умовою утворення функціонального «шипа» і не призводить до втрати гемагглютінірующей активності і інфекційності (Laza-rowitz et al., 1971, 1973a; Stanley et al., 1973a). У субодиниці НА, що піддалося розщепленню, два глікопептидами утримуються в безпосередній близькості один від одного за рахунок існування дисульфідних містків і можуть диссоциировать при спільній дії SDS і відновлюють агентів (Laver, 1971).

  Визначення молекулярної маси для HAi і НА2, ізольованих з декількох препаратів вірусу, культивованих на одних і тих же клітинах-господарях, показали, що ці глікопептиди варіюють за розмірами від препарату до препарату не більше ніж інтактні субодиниці НА (Schulze, 1970). Однак смуги НА; і НА2 при електрофорезі в SDS-поліакриламідному гелі звичайно ширше, ніж смуга НА, що вказує на наявність гетерогенності обох продуктів розщеплення. Величини молекулярної маси HAi і НА2, отримані від двох штамів вірусу, культивованих на одних і тих же клітинах, також можуть різнитися (Klenk et al., 1972; Stanley et al., 1973a). Таким чином, різниця в послідовності амінокислот поліпептиду НА призводить до відмінностей або в місці розщеплення, або в розподілі олігосахаридних ланцюжків вздовж молекул поліпептидів. Розщеплення, ймовірно, виникає в однакових, обмежених за кількістю, місцях поліпептидного ланцюга у разі культивування вірусу в певних умовах. Глікопептиди HAi і НА2 можуть бути отримані за допомогою обробки віріонів трипсином (Schulze, 1970; Lazarowitz et al., 1971, 1973a) або плазміном (Lazarowitz et al., 1973b; див. також гл. 2). У цих умовах розщеплення повинно призводити до утворення продуктів НА, і НА2; на С-кінці одного з яких знаходиться залишок аргініну або лізину.

  1. Хімічний склад ізольованих глікопептидів

  Протеолітичні розщеплення субодиниці НА корисно для вірусологів (навіть якщо цей процес виявиться не настільки істотним для самого вірусу), оскільки воно дозволяє нам аналізувати дві частини молекули окремо і описувати функції кожної з цих частин. Глікопептиди НА, я НА2 з штамів АО / Bel H0N1 і B / Lee, культивованих на курячих ембріонах, були розділені за допомогою ультрацентрифугирования в градієнті сахарози; містить гуа-віділгідрохлорід і дітіотріетол (Laver, 1971; Laver, Baker, 1972).

  НА2 виділені з штаму АО / Bel після їх деградації трипсином, свідчать про виразних відмінностях, що в свою чергу вказує на відмінність у їх лоследовательно-стшяяашслот (Laver, 1971; див. також тл. 11, де описані триптичних пептидні карти глікопептидів НА, і НА2 для довгих штамів вірусу).

  Laver і Webster (1972, 1973) використовували пептидні карти для з'ясування молекулярних механізмів антигенних зрушень в гемагтлютініне. Використовуючи тільки триптичних пептиди, розчинні при рН 6,5, вони порівняли пептидні карти двох зазначених вище глікопептидів, виділені з різних штамів вірусу грипу тина А. У штамах антигенно досить віддалених один від одного, вони виявили велику різницю в послідовності амінокислот як для НАь так і для НА2, а в близькоспоріднених штамах спостерігалися тільки невеликі відмінності. Генетичне пояснення цих результатів буде дано в, гл. 10. Що стосується структури гемаглютиніну, то з отриманих розходженні пептидних карт ясно, що глікопептиди навіть з різко різними послідовностями амінокислот здатні приймати конфігурацію активного гемаглютиніну. У зв'язку з цим зрозуміло, чому вірус грипу так вариабелен за своїми антигенними властивостями. Якби стерические вимоги для утворення біологічно активного гемаглютиніну були досить жорсткі, то не були б можливі суттєві, зміни в послідовності його амінокислот. І як наслідок цього положення мутації в гемаглютиніну замість того, щоб бути корисними вірусу, були б для нього згубні. Велика частина вуглеводів, що входять до складу субодиниці НА, мабуть, асоційована з глікопептидами НАь У вірусі штаму АО / Bel до складу НА, входить в 5 разів більше глюкозаміну, ніж його знаходиться в НА2, хоча ці два глікопептидами відрізняються за вмістом білка тільки в 2 рази (Laver, 1971). Таким чином, вуглеводи «залишать більшу частину в глікопептидами НАь ніж в глікопептидами НА2. Крім глюкозаміну, до складу НА, входять фукоза, галактоза і манноза (Laver 1971) Сіалова кислота, ймовірно, в вирионе відсутній (Klenk, Choppin, 1970; Klenk et al., 1970). Однак може бути приєднана до обох частин субодиниць НА (штам A0/WSN) вже після сформування цільних віріонів за допомогою спеціального ферменту (Schulze, 1973a, см. також частина IV цієї глави). До НА, приєднувалося в 5 разів більше залишків сиаловой кислоти, ніж до НА2. Використовуваний фермент переносить залишок сиаловой кислоти з-ціті-Дуйн 5> монофосфату сиаловой кислоти на лицьовій залишок галактози, локалізований на глікопротеїди (Bartholomew, Jourdian, 1966).

  Утворилися чи кінцеві галактозна залишки гемаглютиніну шляхом відщеплення сиаловой кислоти за допомогою нейрамінідази. Або неповного синтезу вуглеводної ланцюга, - невідомо. Фукоза - інший цукор, часто виявляється в кінцевому положенні у олигосахаридов, не включений до НА2 деяких вірусних штамів, тоді як глюкозамін завжди входить до складу цього глікопептидами (див. гл. 2). Чи може фукоза включатися до складу сформованих вірусних частинок in vitro - невідомо.

  Як видно з табл. 9, НА] і НА2 містять приблизно рівну молярне кількість тирозину. Stanley і Haslam (1971), однак, виявили, що НА2, менший з двох гліконептідов, може бути йодовану більшою мірою, ніж НАь Таким чином, ймовірно, залишки тирозину в НА частини НА менш доступні за рахунок конформаційних обмежень.

  І, нарешті, амінокислотний склад гемаглютиніну, виділеного з штаму B / Lee, як було показано Laver і Baker (1972), подібний з амінокислотним складом гемаглютиніну АО / Bel ці дослідники також показали, «то до складу глікопептидами HAj входить близько 90% проліну гемаглютиніну . Оскільки цей амінокислотний залишок перешкоджає утворенню а-спіральної конфігурації, його нерівний розподіл між двома частинами субодиниці НА може мати важливі «інформаційні наслідки.

  2. Антигенні властивості глікопептидами HAt

  Оскільки (глікопептид HAi гемаглютиніну орієнтований так, що знаходиться у водній фазі, навколишнього вирион, можна очікувати, що саме він повинен містити область (або області), яка взаємодіє з еритроцитами, клітинами-господарями, розчинними інгібіторами і антитілами. Інформація про це в даний час ще недостатня. Однак з штаму PR8 (НТШ) був ізольований ге-магглютінінсвязивающій антиген (НАВА), ймовірно, що представляє собою димер глікопептидами HAi (Eckert, 1966, 1969, 1973). Це молекулярне освіта не володіло ге-малглютінірующімі властивостями, але реагувало з антитілами, специфічними для вірусного гемаглютиніну. При обробці детергентом і дітіотріетолом антиген диссоциированного на фрагменти з молекулярною масою близько 40 000. Антиген кількісно видаляв HI-антитіла з імунної сироватки, приготовленої проти цілого вірусу. Він, крім того, індукував освіту HI-і нейтралізують антитіл. Склад амінокислот, НАВА схожий з таким глікопептидами НАЬ виділеного з штаму АО / Bel. Однак, як уже вказувалося, HAi і НА2, виділені з штаму Bel, подібні за складом амінокислот (виключаючи зміст. пролина), та їх відмінність може бути з'ясовано тільки за допомогою методів визначення послідовності амінокислот.

  Експерименти, проведені Brand і Skehel (1972), також вказують, що HAi може містити антигенні детермінанти, що індукують утворення специфічних проти гемаглютиніну антитіл. Отриманий за допомогою обробки бромелайн кристалічний гематглютінін давав одну смугу преципітації з антисироваткою проти цілого вірусу або проти HAj. Лінія преципітації в реакції з антисироватки проти НА2 'спостерігалася лише після додавання-до кристалічному сгемагглютініну відновлюють агентів. Ці факти вказують на те, що функціональний антигенний центр интактного гемаглютиніну локалізований на глікопептидами НАЬ а додатковий центр, розташований на НА2, оголюється тільки після дисоціації HAi і НА2. Проте нещодавно було виявлено, що кожна субодиниця гемаглютиніну містить кілька антигенних детермінантів і що один з них втрачається при виділенні гемаглютиніну за допомогою обробки бромелайн (Laver et al., 1974; див. також гл. 10). Деякі антигенні центри, ймовірно, локалізовані повністю на НАЬ в той час як інші можуть частково або повністю включати ділянки глікопептидами НА2. Вплив розщеплення субодиниці НА на антигенну активність цих центрів ще належить вивчити.

  Субодиниці НА, ізольовані із зруйнованого за допомогою детергента вірусу, володіють гідрофобними властивостями. Наприклад, видалення детергенту з препарату зруйнованого вірусу призводить до утворення великих за розмірами агрегатів, що володіють гематглютінірующей активністю. Ймовірно, за цю здатність субодиниці НА та агрегації відповідальний глікопептид НА2. Після відділення від HAi за допомогою детергентів і відновлюють агентів молекули НА2 утворюють агрегати навіть у присутності Гуань-дінгідрохлоріда і дітіотріетола (Laver, 1971). Однак субодиниці НА, екстраговані з вірусної частки за допомогою бромелайна, що не агрегує (Laver, 1973). Такі субодиниці не володіють здатністю агглютинировать еритроцити, але реагують з антисироваткою проти гемаглютиніну, «виділеного з того ж штаму за допомогою SDS. Субодиниці містять глікопептид НА2, молекулярна маса якого на 5000 менше молекулярної маси аналогічного глікопептидами, отриманого з гемаглютиніну при руйнуванні вірусу за допомогою детергента. Таким чином, при обробці бромелайн, ймовірно, від НА2 отщепляется гідрофобна область, відповідальна за здатність субодиниць НА агрегувати в розчині.

  Раніше Laver (1973) встановив, що амінокислоти, включені в гідрофобну область НА2, повинні бути локалізовані на одному (або обох) кінці молекули, оскільки видалення цій області не призводить до деградації НА2 до фрагментів з малою молекулярною масою.

  Зовсім недавно Skehel і Waterfield (1975) показали, що звичайний: і модифікований за допомогою брамелайна НА2 має ідентичну послідовність амінокислот на N-KOH-це молекули. Тому амінокислоти, отщепляют бромі-лайном, повинні локалізуватися на С-кінці поліпептиду НА2. Ця частина НА2 довжиною близько 50 амінокислотних залишків містить близько половини всіх залишків серину, що входять в цю молекулу. Вважається, що приблизно 21 амінокислотний залишок з 50 володіє гідрофобними властивостями.

  4. Структура субодиниці НА

  Схема будови субодиниці НА, що базується на описаних у цьому розділі експериментальних даних, представлена ??на рас. 13 і зображує субодиницю НА як молекулу гликопротеида з молекулярною масою близько 80 000 з ділянкою, чутливим до дії трипсину, розташованим на відстані * / з від кінця молекули. Гідрофобна область розташована у одного з кінців субодиниці НА. Розщеплення тріпсінчувствятельвой зв'язку (або зв'язків) призводить до утворення двох глікопептидів, HAi і НА2, пов'язаних один з одним за допомогою дисульфідних містків. Базуючись на змісті цистеїну в глікопептидами НА2, наведених у табл. 9, можна зробити висновок, що не більше чотирьох дисульфідних зв'язків з'єднують її з глікопептидами HAi1. Відновлюючі агенти поділяють ці розщеплені субодиниці на два лоліпептіда - НА] і НА2. Поліпептид HAi містить основну частину вуглеводної компоненти, а субодиниця НА2 володіє гідрофобними властивостями. Деякі з олігосахаридів, приєднаних як до НАЬ так і до НА2, мають на кінці галактозу, і до них можуть бути приєднані залишки сиаловой кислоти. Один або більше число антигенних центрів розташовані повністю на глікопептидами НАь а один додатковий антигенний центр показаний у складі НА2. Область зв'язування еритроцитів також локалізована на НАь хоча НА2-область. молекули може відігравати істотну роль при утворенні активних олігомерів.

  При розщепленні поліпептиду НА поліпептид НА2, ймовірно, відщеплюється від його карбоксильного кінця (Skehel, Waterfield, 1975), оскільки в результаті розщеплення образу-

  ється N-'кінець поліпептиду НА2; і С-кінець поліпептиду i Skehel і Waterfield порівняли послідовність перших 10 N-.концевих амінокислотних залишків лоліпептіда НАЬ ізольованого з трьох антигенно різних штамів вірусу грипу людини типу А. Послідовність амінокислот виявилася однаковою за винятком одного або двох положень. Однакова послідовність амінокислот була також виявлена ??для N-кінця поліпептиду-НА2) виділеного з антигенно різних гемагглютининов. Було досліджено 5 штамів вірусу грипу людини типу А і один штам вірусу грипу типу В. Досліджений ділянку поліпептиду включав в основному гідрофобні амінокислотні залишки. У складі цієї ділянки був, крім того, знайдений паліндром з 7 амінокислот, який як вважають Skehel і Waterfield (1975), може служити ділянкою впізнавання для протеаз, що розщеплюють субодиницю НА з утворенням частин HAi і НА2.

  Ці результати, спільно з даними Laver і Webster (1972, 1973) з вивчення варіабельності пептидних карт після розщеплення трипсином, вказують на те, що послідовність амінокислот у деяких частинах молекули гемаглютиніну висококонсерватівна, в той час як послідовність 1в інших ділянках цієї молекули лабильна. Можливо, саме ті області, в яких послідовність амінокислот змінюється, відповідальні за антигенну мінливість, в той час як стабільні ділянки служать для підтримки тривимірної структури активного гемаглютиніну. У результаті подальших, більш інтенсивних, досліджень послідовності амінокислот в гемаглютинін, ймовірно, будуть виявлені розмір вариабельного ділянки (або ділянок) у ньому і частка амінокислот, які можуть бути замінені без порушення структури і функції субодиниці НА.

  5. Антигенна гомогенність субодиниць НА

  Як було зазначено вище, активний гемаглютинін включає більше однієї субодиниці НА. Це спостереження спільно з тим експериментальним фактом, що для деяких вірусних штамів у складі [гемаглютиніну виявляється кілька різних антигенних центрів, важливий для з'ясування питання про те, чи містить індивідуальний вірусний штам субодиниці НА із суттєво різними послідовностями амінокислот. Це питання має особливе значення для вірусу грипу у зв'язку з фрагментарністю його генома (див. гл. 6). Передбачалося, що при упаковці випадковим чином фрагментів вірусної РНК (може відбутися утворення вірусних частинок з наявністю екстракопій сегментів геному (Compans et al., 1970a). Оскільки в цьому випадку вірусні частинки були б частково диплоїдними, один вірусний штам міг би містити генетичну інформацію для синтезу двох різних типів субодиниці НА, якщо обидві аллели пройдуть через кілька циклів вірусної репродукції.

  Один із способів з'ясувати, чи містить вірусна частка один або кілька типів субодиниць НА, полягає в порівнянні кількості пептидів, що виявляються за допомогою тр'ілтічеекого пептидного картування субодиниць НА, з кількістю пептидів, розрахованим на основі вмісту в субодиниць залишків лізину і аргініну. Це порівняння не може бути здійснено в даний час, оскільки вивчення цільної молекули НА за допомогою методу пептидних карт ще не проводилося.

  Інший підхід до вирішення цього питання полягає у використанні специфічних антисироваток для з'ясування того, розділені Чи антигенні детермінанти просторово. Використовуючи цей метод, Laver і співавт. (1974) показали, що антисироватки, приготована проти однієї з двох детермінант, 'асоційованих з субодиницями НА, преціпі-тирует обидві детермінанти. Ці експерименти є першим аргументом на користь просторової пов'язаності антигенних детермінант (тобто локалізація їх на одній і тій же субодиниці НА). Досліди Laver і співавт. вказують також на те, що використані штами не синтезують двох різних в антигенному відношенні субодиниць НА.

  В. СТРУКТУРА «шпильок» гемаглютиніну

  1. Моновалентний гемаглютинін

  Ізольовані субодиниці НА з молекулярною масою 80 000 не володіють гематглютіяірующей активністю. Найменшою за розмірами активної молекулою є оліго-заходів, сформований або субодиницями НА, або продуктами їх розщеплення-HAi і НА2. Цей моновалентний НА * 1 був вперше ізольований з віріона за допомогою SDS (Laver, 1964; Laver, Valentine, 1969). Він адсорбувався на еритроцитах, але не викликав аглютинації. Гемаглютинін в присутності SDS мав коефіцієнт седиментації, рівний приблизно 7,5 S (Laver, Valentine, 1969), і представляв собою палочкообразниє частинки розміром близько 4-14 нм. Морфологія цих утворень показана на 33 (див. гл. 10). Раніше передбачалося, що моновалентний НА * має молекулярну масу близько 150 000 і складається з двох суб'едінкц НА (Laver, Valentine, 1969). Ця точка зору базувалася на розмірах моновалентного НА *, отриманих за допомогою електронної мікрооколіі, на молекулярній масі субодиниці НА, виміряної за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності SDS, на величині коефіцієнта седиментації моновалентного НА. При цьому вважали, що питома парціальний обсяг дорівнює 0,73 ем3 / м. Проте пізніше було показано, що моновалентний НА * являє собою, ймовірно, тример. Молекулярна маса, визначена методом рівноважної седиментації, виявилася рівною приблизно 215 000 i (Skenel, Charlwood, персональне повідомлення). Ця величина приблизно в 3 рази перевищує величину молекулярної маси субодиниці НА. Крім того, на електронних мікрофото частково зруйнованих вірусних частинок іноді виявляються трикутні структури відповідних розмірів, які, ймовірно, є

  «Шпильками» НА * 1, спостерігаються «в торець» (Laver, 1973; Schulze, 1972, 1973). Цей вид (Молекули в даний час твердо встановлено за допомогою експериментів, коли кристалічну каталазу змішували з високоочищеним НА *, ізольованим за допомогою SDS з вірусу грипу штаму АО / Bel (див. 33, гл. 10). У цих умовах молекули НА * упаковуються регулярним чином так, що фактично всі частки спостерігаються «в торець». При негативному контрастуванні кожна молекула являє собою трикутник, що також вказує на те, що «шип» НА * складається з трьох субодиниць.

  Порівняння морфології і розмірів шару «шпильок» на поверхні інтактно.го вірусу з розмірами ізольованого НА * однозначно підтверджує точку зору, що молекули моновалентного НА * відповідають окремим «шипам», витягнутим з ліпідного подвійного шару. Вивільнення НА * може здійснюватися або за рахунок використання (Молекул детергента, які можуть взаємодіяти з гідрофобною областю «шипа», або за допомогою відщеплення гидрофобной області від НА2-частини субодиниці при протеолизе. Одна вірусна частка містить 300-450 «шпильок» (Schulze, 1973), які приєднані до липидному шару за рахунок (взаємодії з ним НА2-частин тримерів. Деякі штами вірусу, ймовірно, містять менше однієї молекули HAj на молекулу НА2; (Schulze, 1973). Таким чином, деякі «шипи» вир іона, містять розщеплений НА, можуть мати дефектну структуру1.

  2. Агрегація і дисоціація моновалентного гемаглютиніну

  Як було зазначено, гемагглюті'нація мається тільки при наявності мультівалентних молекул, які можуть бути сформовані in vitro в там разі, якщо НА2-частина субодиниці інтактні. Такі агрегати показані на 34 (див. гл. 10). Оскільки вони формуються з різного числа «шипів» НА *, агрегати неоднакові за розмірами.

  Процес дисоціації «шипа» НА * і його агрегації з утворенням часток, що викликають гемаглютинацію, представлені схематично на 14. «Шип» зображений як тример, причому гідрофобна область кожної з трьох субодиниць НА * впроваджена в подвійній лілідний шар вірусної частинки. Ці гідрофобні області видаляються при ізоляції НА * за допомогою протеази (див. 14, А).

  Описана модель заснована на експериментальних даних, отриманих для (великого числа вірусних штамів, проте не всі деталі схеми здійснюються для кожного окремого штаму. Наприклад, спостерігаються великі відмінності в чутливості різних штамів вірусу до дії протеаз (Schulze, 1973). Протеази інактивують і, ймовірно , руйнують НА * багатьох штамів вірусу (Kilbourne, 1969), проте відносно деяких з них має місце Протеазна інактивація, діюча не тільки виключно яа НА *. Kilbourne і еоавт. показали, що НА-антиген може втратити чутливість до лротеазе в процесі генетичної рекомбінації (Kilbourne et al., 1972a). Ці спостереження разом з іншими експериментальними даними показують, як небезпечно робити висновок про структурні перебудовах на основі спостережуваних змін біологічної активності. Дійсно, описана модель передбачає, що НА *, ізольований з вірусної частки за допомогою обробки (бромелайн, зде змінює своєї структури за винятком втрати гидрофобной області. Однак такий НА *, ізольований з деяких штамів вірусу, що не адсорбується на еритроцитах (Laver et al., 1974), що вказує на наявність структурних змін в гідрофільній частини субодиниці (в її НАрчасті). Оскільки ці зміни-мотут бути вкрай незначними, їх можна не помітити, якщо використовувати наявні в даний час фізичні методи.

  IV. ФУНКЦІЇ гемаглютиніну

  Два важливих аспекти, пов'язаних з присутністю НА *, були ясні задовго до проведення детального аналізу структури віріона грипу. Після епідемії грипу в 1947 р. стало ясно, що поверхневі антигени віріона зазнають кардинальних змін свого складу та у зв'язку з цим штами вірусів, що володіють однаковим внутрішнім антигеном, показують у перехресних реакціях нейтралізації і придушення гемаглютинації низьку активність (Francis et al., 1947) . Отже, було показано, що НА * є основним 'поверхневим антигеном і що він один стимулює синтез антитіл, що нейтралізують інфекційність і інгібі-ючий темагглютінацію (Drzeniek et al., 1966; Laver, Kilbourne, 1966). Таким чином, був зроблений висновок, що НА * відповідальний за прикріплення вірусу до клітини-господаря або до еритроцитів і що зміни саме в його структурі впливають на антигенні властивості віріонів.

  Як було показано в розділі III цієї глави, деякі з цих властивостей залишаються притаманними НА * при його відділенні від вірусної частинки. Ізольований НА * може адсорбуватися на еритроцитах і, якщо виконуються умови утворення мультівалентних агрегатів, може викликати гемагглю-тінацію. НА * викликає утворення HI і нейтралізують

  антитіл, якщо навіть в якості антигену використовуються обра

  Бота детергентом молекули, що не володіють гемагглю-

  тінірующей активністю. Ці антитіла в очищеному вигляді

  мають високий ступінь антигенної специфічності, так що

  штаммовие відмінності, характерні для інтактних вірібнов,

  можна успішно досліджувати при використанні субодиниць

  як антигенів. :

  Після з'ясування структури віріона грипу стало також

  зрозуміло, чому очищені віріони містять <у своєму соста

  ве так званий антиген господаря. Було з'ясовано, що цей

  антиген, що виявляється і в очищених препаратах вірусу

  (Knight, 1944; Harboe et al., 1961; Harboe, 1963), є

  вуглеводної частиною поверхневих глікопротеїдів. Він пред

  складало собою гликопротеид, позбавлений залишків еіалових

  кислот (Hankenes et al., 1966; Laver, Webster, 1966), реаг

  ровал з антитілами до НА * і блокував їх Ш-активність.

  Ці крос-реакції спостерігаються у зв'язку з тим, що НА * содер

  жит олігосахариди, синтезовані ферментами клітини-

  господаря з пулу підходящих вуглеводних залишків, які

  тому подібні з олігосахаридами, що містяться в гли-

  копротеідах клітини-хазяїна. . . . .

  Інформація, отримана при використанні в якості об'єкта дослідження ізольованого НА *, була вкрай корисна для з'ясування структурних взаємин усередині «шипа» НА * і у вирішенні питання, які частини «шипа» здатні зв'язуватися з лііідним подвійним шаром, а які - взаємодіють з клітинними рецепторами . Однак розуміння ролі «шипа» НА * у приєднанні віріонів до еритроцитів і до хазяйським клітинам можливо тільки при вивченні НА * in 'situ. У зв'язку з цим робилися спроби змінити НА *, що входить до складу віріона, для того, щоб скор-реліровать зміна в його структурної організації із змінами в його властивості.

  16. Вплив приєднання залишків сиаловой кислоти на біологічні властивості вірусу грипу. Очищений вірус штаму A0/WSN інкубували з ЦМФ-сиаловой кислотою і сіалілтрансферазой. Під час інкубації відбирали аліквоти для визначення гемагглютінірующей і нейро-нідазной активності і інфекційності. Нейрамііідазную активність визначали за швидкістю відщеплення сиаловой кислоти від фетуііа за допомогою колориметрического методу Aminoff (1961). Інфекціовность визначали методом підрахунку бляшок в моноелюях клітин МДВК (Madin, Diarby, 1958) і фибропластов курячого ембріона (CEF). Вірусні частинки з відщеплення за допомогою трипсину нейрамінідазою (ом. табл. 10) інкубували в тих же умовах і їх активність визначали тим же способом. Контролі, містять внтактний або тріпсінізіроваяний віруси, інкубували в тому ж середовищі за винятком ЦМФ-еваловой кислоти. Після інкубації протягом 6 год при 137 СС контролю володіли 100% гемагглютінірующей активністю і приблизно 60 і 10% початкової інфекційності і нейрамінідазной активності. 'Світлі значки відносяться до тріпеінізірованном'у (вірусу (Schulze, 1975).

  Досить несподівані біологічні наслідки. Приєднання до гем агглютинина in vitro залишків сиаловой кислоти підсумовані на 16. Гемагглютінірующімі активність втрачається, нейрамінідазной активність залишається тією ж, як для инкубировались (Контрольного вірусу, а й-нфекціон-ність значною мірою зростає. Ступінь зростання інфекційності залежить від кількості приєднаної сиаловой кислоти, від клітин, на яких проводилося визначення інфекційності, і від того , чи був вірус попередньо оброблений трипсином для видалення його власної NA * 1.

  Залишки сиаловой. Кислоти, приєднані, до інтактних вірусу in vitro, можуть бути видалені за допомогою NA * Сіалі-зідірованних віріонів, якщо будуть створені оптимальні для роботи цього ферменту умови (Schulze, 1975a, b). У зв'язку з цим цілком імовірно, що вірусна NA * отщепляет від віріони НА * залишки сиаловой кислоти, що приєднуються до нього сіалілтраноферазамі клітини-хазяїна. Докази на користь такого механізму були вперше приведені Palese і співавт. (1974) і будуть описані в гл. 4. Однак ковалентное приєднання сиаловой кислоти до вірусних гліколротеідам або до їх попереднику in vivo ще не було здійснено.

  Механізм збільшення інфекційності гару ковалентном приєднання сиаловой «кислоти [в даний час з'ясовується. Оскільки спостережувана ступінь збільшення інфекційності частково залежить від того, який тип клітин використовується для визначення інфекційності, цілком імовірно, що приєднання залишків сиаловой кислоти збільшує ступінь зв'язування віріонів з якимись клітинними рецепторами. У цьому зв'язку цікаво відзначити, що, за попередніми даними, сіалізідірованние віріони, що не володіють гемагглютінірующей активністю, мабуть, приєднуються, до курячим еритроцитам так само, як контрольні віріони (Schulze, неопубліковані дані). Ці результати вказують на те, що за деяких умов гемагглю-тінація є неточним індикатором наявності взаємодії віріонів з рецепторами еритроцитів, не кажучи вже про взаємодію їх з рецепторами хазяйських клітин.

  Аналогічні зміни активності можуть бути викликані за допомогою обробки вірусу грипу фетуіном - глікопро-теідом, що містить залишки сиаловой кислоти (Der, Schulze, 1975). Контакт віріонів з фетуіном призводить до втрати ними гемагглютінірующей активності і збільшує інфек-ціонность препарату (табл. 11). Для запобігання деструкції інгібітора вірусної нейраміяідазой вірусні зразки обробляли трипсином перед інкубацією з фетуіном. Оброблені трипсином препарати, що не володіють нейрамінідазной активністю, втрачали гемаатлютінірующую активність і значно. Збільшували свою інфекційність після інкубації з фетуіном. Видалення залишків сиаловой кислоти з фетуіном у великій мірі знижувало його стимулюючу дію і оброблений фетуін переставав бути інгібітором гемаглютинації. Це вказує на те, що

  залишки сиаловой кислоти повинні брати участь у зміні обох активностей. Наведені результати показують, що адсорбція віріонів на клітинах-господарях може бути полегшена шляхом додавання деяких водорозчинних Глік-протеидов, що містять у своєму складі залишки сиаловой кислоти. Це збільшення інфекційності, так само як і у випадку сіалізідірованних віріонів, може бути пов'язано з утворенням агрегатів, які є причиною інфекції, як це спостерігається при агрегатах неповних, але комплементаціонних вірусних частинок (Hirst, Pons, 1973). Незалежно від того, яка з цих альтернатив насправді має місце, ймовірно, настав час переглянути наші погляди на роль сіалосодержащіх гликопротеидов в інфекційному процесі, оскільки деякі з цих молекул, мабуть, стимулюють інфекцію замість її пригнічення.

  Незалежно від того, який механізм відповідальний за втрату гемагглютінірующей активності і збільшення інфекційності Наведений вище експериментальний матеріал підтверджує той факт, що приєднання сиаловой кислоти до 1гемагглютініну або взаємодія вірусу з СІА-лосодержащімі гликопротеидами призводить до виникнення інфекційних, але не агглютинирующих вірусних частинок. Інфекційні вірусні частки, що не володіють гемагглютінірующей активністю, спостерігалися раніше в персистентно інфікованих культурах клітин (Gavrilov et al., 1972) внаслідок хіміотерапевтичне обробки мишей (Mag-rassi et al., 1966) і в процесі адаптації штамів вірусів грипу типу А2 до нових клітинам-господарям (Thibon et al., 1967). Оскільки ні в одному з цих випадків вірусні частки не дослідили після їх очищення, механізм інгібуючої-вання гемаглютинації поки ще не ясний. Thibon і співавт.

  (1967) припустили, що в їх дослідах гемапглютінін на поверхні віріона був присутній, оскільки він викликав синтез HI-антитіл, але був замаскований. Інгібітори ж вірусу грипу типу А2 в культуральному середовищі не виявлялися.

  V. ВИСНОВОК

  Велика частина наведеної в цьому розділі інформації про віруси грипу 'була отримана на штамах вірусу грипу типу А. Хоча IB даний час є мало даних про віруси інших типів, структура НА * вірусу грипу типу В, мабуть, дуже схожа із структурою НА * вірусу грипу типу А (ом. гл. 2 і розділ III цієї глави). Про віруси грипу типу С тут не згадувалося, оскільки в даний час відомості про структуру їх НА * повністю відсутні.

  Нам хотілося б обговорити деякі аспекти взаємодії між вірусним НА * і еритроцитами. Враховуючи те, що ми знаємо нині про молекулярну структуру рецепторів еритроцитів і вірусного НА *, можна зробити висновок, що явище гемаглютинації є взаємодія між молекулами, які дуже подібні за своїм складом і структурою, але резжо відрізняються за своїми зарядовим властивостям. Каж вірусний НА *, так і вірусні рецептори еритроцитів є низькомолекулярними гли-копротеідамі, схильними до агрегації після їх ізоляції. У нативному вигляді обидва тлікопротеіда мають специфічні місця, чутливі до трипсину, обидва гликопротеида мають гідрофобну частину в області карбоксильного кінця молекули і гідрофільну область у N-кінця. Ці властивості характерні для більшості асоційованих з мембранами глікопро-теідов. Різниця між цими двома молекулами полягає в різному змісті в них залишків сиаловой кислоти. У той час як для гликопротеида еритроцитів зміст сиаловой кислоти становить 27%, у вірусному гликопротеидом СІА-ловая кислота відсутня. Оскільки при фізіологічних значеннях рН карбоксильная група сиаловой кислоти знаходиться в іонізованому стані, іонне оточення еритроцита повинно значно відрізнятися від іонного оточення вірусної частинки.

  Багато особливості взаємодії вірусу з еритроцитами можуть бути пояснені на основі цих відмінностей в зарядових властивостях. . У цьому зв'язку важливо відзначити, що адсорбція вірусів на еритроцитах не повинна розглядатися як явище, еквівалентну гемаглютинації. Хоча прикріплення вірусної-частинки до рецептора еритроцита і є необхідною умовою гематоглютінаціі, вона не служить лімітуючим фактором при формуванні сітчастої структури або агрегату. Наявність різних точок зору на процес взаємодії вірусних частинок з еритроцитами безсумнівно-було пов'язано з тим, наскільки ми були в змозі вивчати ізольовано процеси вірусної адсорбції і. Гемаглютинації. У багатьох роботах ставиться знак рівності між адсорбцією і гемаглютинацію, оскільки в даний час ще не розроблена методика вивчення процесу адсорбції вірусних частинок на клітинну поверхню.

  Крім того, важливо усвідомлювати, жак мало ми знаємо про хімічний склад вірусних рецепторів, локалізованих на клітинах-господарях і грають роль в інфекційному іроцессе. Природно, однак, припускати, що ці рецептори різко відрізняються від рецепторів еритроцитів. Гликопротеид еритроцитів людини містить більше залишків сиаловой кислоти, ніж гликопротеид плазматичних клітинних мембран (Spiro, 1973). і його питома вага в загальному білковому змісті еритроцитів більше, ніж питома вага будь-якого з гли-копротеідов плазматичних мембран (Hughes, 1973). У той час як всі залишки сиаловой кислоти можуть бути легко видалені з поверхні еритроцитної мембрани за допомогою нейрамінідази (Eylar et al., 1962), в інших клітинах деякі з тажіх залишків нечутливі до обробки цим ферментом (Glick et al., 1970). (Передбачається, що ці нечутливі до нейрамінідазі залишки сиаловой жіслоти локалізовані на гліколіпідами (Glick et al., 1970) і залучені в процеси адсорбції вірусу і проникнення його в клітину (Haywood, 1974). Прикріплення вірусу ж клітинам-господарям у багатьох випадках може бути проконтрольовано шляхом-вимірювання інфекційне ™ вірусної суспензії. Як і у випадку гемаглютинації, цей метод індикації вимагає, щоб здійснювалися всі наступні за адсорбцією процеси. Таким чином, адсорбція вірусу на клітину-господаря і на еритроцити включає два незалежних процесу і жоден з них не був раніше вивчений за допомогою таких методик, які дали б відповідь на цікаві для нас питання.

  У світлі всього викладеного хотілося б відзначити, що ми досить необачно дали назву головному поверхневому глікопротеїди вірусу грипу. Для нас він є ге-магглютініном просто тому, що ми можемо (кількісно вивчати процес саме гемаглютинації, однак у вірусній частці цей гликопротеид грає іншу роль. Хоча некоректно вбрання нами назва цього гликопротеида і не може змінити його функцію, воно в. Якийсь мірі впливає на наше сприйняття того, каж цей гликопротеид взаємодіє з клітинами. Характерні риси гемаглютиніну, наведені тут, в основному отримані на основі експериментів з визначення його гемагглютінірующей активності. Нині є більш ефективні методики вивчення взаємодії віріона з клітинами-господарями і

  з еритроцитами. Оскільки ми не можемо розраховувати на інтуїцію, яка допомогла б нам зрозуміти сутність явища без кропіткої роботи, цілком імовірно, що, ми краще зрозуміємо наз'наченіе того 'поверхневого гликопротеида, (Якому ми дали назву «гемаглютинін», якщо не будемо намагатися знайти пряму аналогію між його взаємодією з еритроцитами і клітиною-господарем.



  ЛІТЕРАТУРА

  Ada G. L., Perry В. Т. Aust. J. exp. Biol. Med., 1954, v. 32, p. 453.

  Aminoff D. Biochem. J., 1961, v. 81, p. 348.

  Bartholomew B. A., Jourdian G. W. In: Methods in Enzymology (EF Newfeld and V. Ginsburg, eds.), New York, Acad. Press, 1966, v. 8, p. 368-372. Bateman J. В., Davis M. S., McCaffrey P. A. Am. J. Hyg., 1955, v. 62,

  p. 349. Brand С. М., Skehel J. J. Nature (London), New Biol., 1972, v. 238,

  p. 145. Burnet F. M., McCrea J. F. Aust. J. exp. Biol. Med. Sci., 1946, v. 24,

  p. 277. Burnet F. M., McCrea I. F., Stone J. D. Brit. J. exp. Path., 1946

  Choppin P. W., Tamm I. Virology, 1959, v. 8, p. 539. Choppin P. W., Tamm I. J. exp. Med., 1960, v. 112, p. 921. Chu З M. J. gen. Microbiol., 1951, v. 5, p. 739. Cohen A., Belyavin G. Virology

  Cohen A., Belyavin G. Abstr. int. Congr. Microbiol., 1966, 9th, p. 379. Compans R. W., Dimmock N. J., Meier-Ewert H. In: The Biology of Large

  RNA Viruses (RD Barry and BWJ Mahy, eds.), New York, Acad.

  Press, 1970a, p. 87-108. Compans R. W., Klenk H.-D., Caliguiri L. A., Choppin P. W. Virology, 1970

  Der C.-L., Schulze I. T. In preparation, 1975. Drescher J. Zbl. Bakteriol., Parasitenk., Infektionskr. Hyg., Abt. I: Orig

  Drescher I. Am. J. Epidemiol., 1966, v. 84, p. 167. Drescher J, Am. J. Epidemiol., 1967,

  Drzeniek R., Seto J. Т., Rott R. Biochim. biophys. Acta, 1966, v. 128, p. 547. Eckert E. A. J. Bacteriol, 1966, v. 92, p. 430. Eckert E. A. J. Immunol., 1969, v. 102, p. 1105. Eckert E. A. J. Virol., 1973, v. 11, p. 183. Eylar E. H., Madoff M. A., Brody O. V., Oncley J. L. J. biol. Chem., 1962,

  v. 237, p. 1992. Fazekas de St Groth S., Gottschalk A. Biochim. biophys. Acta, 1963, v. 78,

  p. 248.

  Finter N. B. Virology, 1964, v. 24, p. 589. Francis T. J. exp. Med., 1947, v. 85, p. 1. Francis Т., Salk J. E. Science, 1942, v. 96, p. 499. Francis Т., Salk J. E., Quilligan I. J., Jr. Am. J. pub. Hlth, 1947, v. 37,

  p. 1013. Frommhagen L. H., Knight C. A., Freeman N. K-Virology, 1959, v. 8,

  p. 176. Gavrilov V. I., Asher D. M., Vyalushkina S. D., Ratushkina L. S., Zmieva R. G.,

  Tumyan B. G. Proc. Soc. exp. Biol., 1972, v. 140, p. 109. Glick M. C, Comstock C, Warren L. Biochim. biophys: Acta, 1970, v. 219. 
« Попередня Наступна »
= Перейти до змісту підручника =
 Інформація, релевантна "Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін"
  1.  Кільбурн Е.Д.. Віруси грипу та грип (1978), 1978
      Книга присвячена огляду різноманітних вірусів грипу, їх культивування, біохімії і особливостям молекулярного пристрою. Зміст: Віруси грипу та грип. Структура вірусу грипу. Біологічно активні білки вірусу грипу. Гемаглютинін. Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу. РНК вірусів
  2.  Віруси грипу та грип
      Е. Д. Кільбурн (Е. D. KILBOURNE) I. ВСТУП. ГРИП - ЗАХВОРЮВАННЯ З Незмінних симптоматики, викликає Змінюється ВІРУСОМ Величезний інтерес, який притягається до сучасної вірусології до грипу і вірусів, відповідальним за його виникнення, вимагає пояснення, якщо врахувати ординарний характер симптоматики цього, зазвичай дуже помірного, інфекційного захворювання дихальних шляхів
  3.  Структура вірусу грипу
      П. В. ШОППІН І Р. В. КОМПАНС (PW CHOPPIN, Я. W. COMPANS) I. ВСТУП Вивчення вірусу грипу протягом тривалого часу перебувало «а передовому рубежі структурних досліджень у вірусології. Вірус грипу одним з перших був вивчений: допомогою електронної мікроскопії (Taylor et al., 1943), і при використанні саме цього об'єкта в якості моделі було "вчинено, що деякі віруси
  4.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Нейрамінідазу
      Д. Букера і П. ПАЛЕЙЗІ (BUCHER, P. PALESE) I. ВСТУП Існування нейрамінідази вперше припустив в що стала нині вже класичній роботі Hirst (1942). Він виявив, що якщо агглютінірованних у присутності'іруса грипу еритроцити деагглютініровать, то при додаванні до них 'нового вірусу вони знову не здатні до аглютинації. При цьому, однак, елюіровать вірус не
  5.  . Білки вірусів
      3.1.Амінокіслотний склад вірусних білків Білок всіх досліджених до теперішнього часу вірусів побудований із звичайних амінокислот, які належать до природного L-ряду. D-амінокислот у складі вірусних частинок не знайдено. Співвідношення амінокислот у вірусних білках досить близько до такого в білках тварин, бактерій і рослин. Вірусні білки не містять зазвичай великої кількості
  6.  ПРИНЦИПИ ВІРУСОЛОГІЇ
      Кеннет Л. Тайлер, Бернард Н. Філдс (Kenneth L. Tyier, Bernard N. Fields) Структура і класифікація вірусів. Типова вірусна частка (вирион) містить ядро, що складається з нуклеїнової кислоти - ДНК або РНК. Існує значна варіабельність структур і розмірів вірусних нуклеїнових кислот (табл. 128-1). Геноми з мінімальною мовляв. масою, як, наприклад, у парвовирусов, налічують 3-4
  7. А
      список А, група отруйних високо токсичних лікарських засобів, що передбачається Державною фармакопеєю СРСР; доповнюється і змінюється наказами Міністерства охорони здоров'я СРСР. При поводженні з цими лікарськими засобами необхідно дотримуватися особливої ??обережності. Медикаменти списку зберігаються в аптеках під замком в окремих шафах з написом «А - venena» (отруйні). Перед закриттям
  8. Г
      + + + Габітус (лат. habitus - зовнішність, зовнішність), зовнішній вигляд тварини в момент дослідження. Визначається сукупністю зовнішніх ознак, що характеризують статура, вгодованість, положення тіла, темперамент і конституцію. Розрізняють статура (будова кістяка і ступінь розвитку мускулатури): сильне, середнє, слабке. Вгодованість може бути гарною, задовільною,
  9. Н
      + + + Гній, цінне органічне добриво, що складається з екскрементів тварин, рідких відходів ферм і підстилкового матеріалу (солома, торф, тирса). Н. містить велику кількість мінеральних і органічних речовин, внесення яких в грунт підвищує її поживні властивості. Залежно від методу утримання тварин та системи збирання приміщення розрізняють Н. рідкий, напіврідкий і твердий. Рідкий
  10.  Біологічно активні білки вірусу грипу. Активність транскриптази в клітинах і вирионах грипу
      Р. В. ОІМПСОН і В. Д. БІН (RW SIMPSON, WJ BEAN, JR.) I. ВСТУП Ця глава «освячена досить новому розділу в біології вірусу грипу, у зв'язку з чим більша частина інформації фрагментарна по-своєму складу сі включає велике число невирішених питань. Основне твердження, на якому грунтується дана глава, полягає в тому, що мікоовіруси є вірусами з негативним геномом
загрузка...

© medbib.in.ua - Медична Бібліотека
загрузка...